臭氧水對(duì)小鼠急性毒性和蓄積毒性試驗(yàn)

　　摘 要：用昆明種小白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)和蓄積毒性試驗(yàn)，來評(píng)價(jià)臭氧水的毒性。急性毒性試驗(yàn)采用最大給藥法，試驗(yàn)組取濃度≥20mg/kg的臭氧水按20g/kg體質(zhì)量限量，一次灌胃，觀察14d內(nèi)小鼠的死亡情況，計(jì)算半數(shù)致死量(MedianLethalDose，LD50)。蓄積毒性試驗(yàn)采用劑量遞增法，按體質(zhì)量計(jì)算染毒劑量。處理后1～4d小鼠染毒劑量為0.1倍的LD50，按20g/kg體質(zhì)量，一次灌胃給藥，以后每4d遞增1.5倍劑量，直至20d。每4d對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重，統(tǒng)計(jì)增重和采食量，并測定小鼠器官指數(shù)，觀察胃組織切片。結(jié)果表明：試驗(yàn)期間無小鼠死亡，臭氧水對(duì)小鼠的經(jīng)口 LD50為20g/kg體質(zhì)量，根據(jù)急性毒性分級(jí)，屬實(shí)際無毒物質(zhì)。臭氧水的蓄積系數(shù) K>5。與灌注純凈水的對(duì)照組小鼠相比，灌注臭氧水對(duì)小鼠無任何不良影響。

　　關(guān)鍵詞：昆明小白鼠;臭氧水;急性毒性試驗(yàn);蓄積毒性試驗(yàn)

　　王群; 尹春慶; 劉藝丹; 王利華; 王光 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2021-12-13

　　臭氧作為一種高效廣譜類的抗菌劑，其抑菌作用機(jī)理是氧化破壞微生物細(xì)胞中的重要組成部分，如細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、線粒體與細(xì)胞核等[1]。含有臭氧的水溶液叫做臭氧水，在水中臭氧的半衰期為 20min[2]。臭氧水具有較高的殺菌性能，但是臭氧穩(wěn)定性差、易分解為氧氣，所以使用臭氧水殺菌時(shí)應(yīng)盡量使用流動(dòng)臭氧水，能解決臭氧半衰期短、易揮發(fā)的問題，從而提高臭氧的利用率[3]。臭氧在水中能形成羥自由基，仍具有較強(qiáng)的氧化性[4]。肖彩雯等[5]研究 表 明，用 4 mg/L 的 臭 氧 水 對(duì) 串 珠 菌 作 用 1min，殺菌率為99.86 %，對(duì)煙曲菌作用5min，殺菌率為99.57 %。與臭氧氣體相比，臭氧水應(yīng)用于養(yǎng)殖場更為便捷，不僅可用于環(huán)境消毒，也可對(duì)畜禽飲水進(jìn)行消毒。如果用于飲用水消毒，臭氧會(huì)殘留在水中被畜禽攝入體內(nèi)。為了評(píng)價(jià)高濃度的臭氧水在畜牧生產(chǎn)上的安全性，本試驗(yàn)以昆明小白鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用最大給藥法經(jīng)口灌胃進(jìn)行臭氧水急性毒性試驗(yàn)，采用劑量遞增法進(jìn)行臭氧水的蓄積毒性試驗(yàn)，以確 定 臭 氧 水 的 半 數(shù) 致 死 量 (Median LethalDose，LD50)和蓄積系數(shù) K。

　　1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　臭氧水由青島歐帝歐環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司生產(chǎn)并提供機(jī)器現(xiàn)場制得，經(jīng)在線式溶解臭氧濃度檢測儀(CL7685，淄博愛迪爾測控技術(shù)有限 公 司)分析，臭氧濃度為≥20mg/kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無特定病原體(SpecificpathogenFree，SPF)級(jí)昆明 種 小 白鼠，購于青島市即墨區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可號(hào)為scxk(魯)20040001。體質(zhì)量18～22g，雌雄各半，試驗(yàn)期內(nèi)自由采食、自由飲水(蒸餾水)，采用自然光照，室溫26～30℃。鼠糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，為專用全價(jià)日糧。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　臭氧水的急性毒性試驗(yàn)采用最大給藥法。取小鼠20只(雌雄各半)為試驗(yàn)組，灌注臭氧水前小鼠禁食約12h，不禁水。試驗(yàn)組取濃度為≥20mg/kg的臭氧水按20g/kg體質(zhì)量限量，一次灌胃，灌胃后禁食約2h后再正常喂食;另取10 只小鼠(雌、雄各半)用純凈水替代臭氧水做對(duì)照組。觀察時(shí)間為14d，觀察記錄小鼠的行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、采食飲水以及中毒和死亡情況。在半數(shù)致死量的測定結(jié)果基礎(chǔ)上，選用體質(zhì)量為18～22g昆明種小鼠30只，雌、雄各半。其中20只小鼠采用劑量遞增法進(jìn)行臭氧水的蓄積毒性試驗(yàn)，按體質(zhì)量計(jì)算染毒劑量。第1～4天小鼠染毒劑量為0.1LD50，按20g/kg體質(zhì)量一次灌胃給藥，以后每4d遞增1.5倍劑量，直至20d，染毒方案見表1;另取10只小鼠(雌、雄各半)每天按20g/kg體質(zhì)量灌注純凈水以確定灌注對(duì)小鼠的影響。連續(xù)染毒20d后，若動(dòng)物死亡未達(dá)半數(shù)，染毒累積劑量已達(dá)一次 LD50的5.3倍，即蓄積系數(shù)大于5.0，試驗(yàn)即可結(jié)束;若試驗(yàn)期間動(dòng)物發(fā)生半數(shù)死亡，則可按表1查得相應(yīng)的染毒累積劑量，并計(jì)算累積系數(shù)，按累積系數(shù)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)蓄積毒性。

　　1.3 檢測指標(biāo)

　　在急性毒性試驗(yàn)中，觀察小鼠中毒癥狀及出現(xiàn)時(shí)間，根據(jù)小鼠死亡情況計(jì)算半數(shù)致死量 LD50。在蓄積毒性試驗(yàn)中，確定蓄積系數(shù) K。每4d對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重，統(tǒng)計(jì)增重和采食量，試驗(yàn)結(jié)束后即第21天對(duì)小鼠進(jìn)行屠宰實(shí)驗(yàn)，對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進(jìn)行稱重，并計(jì)算相應(yīng)的器官指數(shù)(器官指數(shù)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某器官質(zhì)量與其體質(zhì)量之比)。取小鼠胃組織相同的部位2cm，用生理鹽水清洗后放入10mL/L 甲醛溶液中進(jìn)行固定。將已固定好的胃組織經(jīng)修整、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟后，用蘇木精-伊紅(HE)進(jìn)行染色，制成胃組織切片。采用光學(xué)顯微鏡(ae-2000，Nikon，日本)觀察切片。

　　1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

　　應(yīng)用 Excel2007，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析，小鼠的體質(zhì)量、器官指數(shù)采用SAS9.4軟件中的 MIXED過程進(jìn)行方差分析，分析臭氧水、性別兩個(gè)主效應(yīng)及二者的互作效應(yīng)對(duì)小鼠生產(chǎn)性能和器官指數(shù)的影響，計(jì)算最小二乘均數(shù)及 標(biāo) 準(zhǔn) 誤，檢 驗(yàn) 誤 差 為 5%水平。

　　2 結(jié)果與分析2.1 臭氧水的半數(shù)致死量

　　在試驗(yàn)進(jìn)行的14d內(nèi)，試驗(yàn)組的小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，觀察期間無小鼠死亡，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由此可判定臭氧水對(duì)小鼠一次經(jīng)口 LD50為 20g/kg體質(zhì)量，根據(jù) GB15193.3—2014急性毒性劑量分級(jí)表，屬實(shí)際無毒物質(zhì)。

　　2.2 臭氧水的蓄積系數(shù)

　　試驗(yàn)觀察期間小鼠連續(xù)染毒已達(dá)到20d，此時(shí)染毒的總劑量已累計(jì)達(dá)到5倍的 LD50以上，小鼠無中毒癥狀和死亡現(xiàn)象，表明臭氧水的蓄積毒性不明顯，因此中止試驗(yàn)。根據(jù)蓄積系數(shù)分級(jí)，判定臭氧水對(duì)小鼠蓄積系數(shù) K>5，為弱蓄積性。

　　2.3 臭氧水灌注對(duì)小鼠生長性能的影響

　　試驗(yàn) 組 與 對(duì) 照 組 小 鼠 的 體 質(zhì) 量 無 顯 著 差 異(P>0.05)，故臭氧水灌注處理對(duì)小鼠的體質(zhì)量沒有顯著影響(P>0.05)。性別對(duì)小鼠體質(zhì)量影響顯著(P<0.05)。第1天時(shí)，雄鼠與雌鼠的體質(zhì)量差異不顯著，從第5天開始，雄鼠的體質(zhì)量均顯著高于雌鼠(P<0.05)。

　　由圖1可以看出，雄鼠的采食高于雌鼠，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠的采食量有降低的趨勢。

　　2.4 臭氧水灌注對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

　　小鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)見表4。試驗(yàn)組小鼠的心臟、肝臟、肺臟和腎臟均未見異常，各器官指數(shù)均表現(xiàn)為對(duì)照組與試驗(yàn)組差異不顯著(P>0.05)。性別對(duì)小鼠的體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)的影響顯著(P<0.05)，雄 鼠 的 體 質(zhì) 量 顯 著 高 于 雌 鼠 (P <0.05)，脾臟指數(shù)顯著低于雌鼠(P<0.05)，腎臟指數(shù)顯著高于雌鼠(P<0.05)。灌注臭氧水與性別間的互作效應(yīng)不顯著(P>0.05)。

　　2.5 臭氧水灌注對(duì)小鼠組織學(xué)檢查的影響

　　對(duì)照組和試驗(yàn)組的小鼠胃組織切片鏡檢結(jié)果分別見圖2和圖3。檢查結(jié)果表明，試驗(yàn)組小鼠的胃的黏膜完整，未見有組織學(xué)損傷。

　　3 討論3.1 臭氧水半數(shù)致死量和蓄積系數(shù)

　　臭氧已廣泛用于飲用水的消毒，臭氧水具有強(qiáng)氧化性和抑菌殺菌能力[6]。趙永強(qiáng)等[7]發(fā)現(xiàn)經(jīng)4.5mg/L濃 度 的 臭 氧 水 處 理30min后 的 羅 非 魚 片 對(duì)SD大鼠經(jīng)口最大耐受劑量(MTD)>15g/kg，毒性分級(jí)為無毒。張敏等[8]對(duì)含16mg/L的臭氧消毒水進(jìn)行毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明16mg/L臭氧消毒劑為實(shí)際無毒、弱蓄積性物質(zhì)，對(duì)小鼠骨髓 PCE 亦無誘變作用，對(duì)動(dòng)物皮膚、眼睛和陰道黏膜均無刺激性，使用安全。本試驗(yàn)制得的臭氧水經(jīng)在線分析系統(tǒng)分析在20mg/L以上，對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)和蓄積毒性試驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)小白鼠有中毒癥狀，可以進(jìn)一步證實(shí)臭氧水為實(shí)際無毒物質(zhì)，具有弱蓄積性。

　　3.2 臭氧水對(duì)小鼠生長性能的影響

　　小鼠存在藏料行為，采食量雖然不能真實(shí)反映小鼠食入的飼料量，但與小鼠的生長呈正相關(guān)。小鼠的生長性能可以間接反映小鼠的生理狀況，理想的生長性能在一定程度上可以說明身體的機(jī)能良好。鄭 云 燕 等[9] 研 究 結(jié) 果 顯 示，10.35～10.95mg/L的臭氧水對(duì)大鼠急性經(jīng)口毒性屬實(shí)際無毒類，大鼠亞急性毒性試驗(yàn)各組動(dòng)物生長發(fā)育良好，體質(zhì)量增加正常。袁安生等[10]證明，通過臭氧處理飲用水和飼料等的試驗(yàn)組比沒有處理的對(duì)照組的雛雞存活率、飼料利用率以及出欄體質(zhì)量都有顯著的提高。沈林園等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過臭氧水處理飲用水后飼喂的雞，發(fā)病現(xiàn)象明顯減少，藥物投入減少，死淘率降低，提高了經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)通過小鼠的體質(zhì)量和采食量也可以證明灌注臭氧水對(duì)小鼠無不良影響。但若想用臭氧水作為畜禽的飲用水以此替代抗生素的 作 用 還 需 要 在 畜 禽 生 產(chǎn) 上 進(jìn) 行 試 驗(yàn) 加 以驗(yàn)證。

　　3.3 臭氧水對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

　　內(nèi)臟器官指數(shù)可以初步作為評(píng)定內(nèi)臟器官是否受到損傷的指標(biāo)。當(dāng)內(nèi)臟器官受到損傷會(huì)發(fā)生炎性反應(yīng)、壞死或出現(xiàn)水腫，最終表現(xiàn)在重量發(fā)生變化。免疫抑制劑可使脾臟重量減輕，一般免疫藥理學(xué)試驗(yàn)常以脾臟的增重或減重作為衡量其免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)[12]。腎是機(jī)體重要的解毒器官，腎功能將直接影響機(jī)體解毒機(jī)能，岳麗紅等[13]的試驗(yàn)數(shù)據(jù)為青年組昆明 小 鼠 (體 質(zhì) 量 為 31.17g)的 腎 臟 指 數(shù) 為15.28，而衰老組的腎臟指數(shù)為16.64。由此可以推斷，本試驗(yàn)中臭氧水灌注組的小鼠的腎臟較純凈水灌注組更為健康。張永東等[14]從酶學(xué)水平研究了臭氧對(duì)肉雞的肺毒性，結(jié)果顯示各臭氧處理組對(duì)肺臟均無明顯損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明純凈水灌注組小鼠的內(nèi)臟器官指數(shù)與臭氧水灌注組之間沒有顯著差異，說明 臭 氧 水 灌 注 對(duì) 小 鼠 無 不 良 影 響。李 玉 冰等[15]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臭氧處理30min、60min、120min，在第 30 天和第 60 天采樣小鼠的臟器系數(shù)與對(duì)照組比 較 無 顯 著 性 差 異。這 與 本 試 驗(yàn) 研 究 結(jié) 果 相一致。

　　3.4 臭氧水對(duì)小鼠組織學(xué)檢查的影響

　　在本試驗(yàn)中，未見臭氧水對(duì)小鼠的胃造成損傷。這從組織學(xué)上進(jìn)一步證實(shí)臭氧水的低毒性。而且臭氧作為一個(gè)強(qiáng)大的氧化劑，會(huì)立即與胃中大量的離子和生物分子即抗氧化劑、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及多不飽和脂肪酸結(jié)合白蛋白反應(yīng)，從而降低臭氧的含量，同時(shí)也會(huì)減少臭氧的毒性。

　　4 結(jié)論

　　臭氧水對(duì)小鼠經(jīng)口 LD50為20g/kg體質(zhì)量，根據(jù)急性毒性分級(jí)，屬實(shí)際無毒物質(zhì);臭氧水對(duì)小鼠蓄積系數(shù) K>5，為弱蓄積性;與純凈水灌注組的小鼠相比，臭氧水灌注對(duì)小鼠無任何不良影響。