云南主栽藍(lán)莓果實(shí)花色苷組成差異分析

　　摘 要：本研究以云南澄江藍(lán)莓主產(chǎn)區(qū) 6 個(gè)品種藍(lán)莓鮮果為對(duì)象，利用高效液相色譜法(HPLC)和加標(biāo)定性測(cè)定法檢測(cè)花色苷組成，通過主成分分析法對(duì)花色苷組成進(jìn)行差異分析。結(jié)果表明，6 個(gè)品種的藍(lán)莓果實(shí)中共檢測(cè)到 10 種花色苷，其中，“比洛克西”的總花色苷含量最高，為 2933.551 mg/kg，芍藥素-3-O-葡萄糖苷在“燦爛”中的含量最高，為 204.42 mg/kg;飛燕草素-3-O-半乳糖苷在 “比洛克西”中最高，為 595.614 mg/kg;主成分分析表明不同品種藍(lán)莓單體花色苷所占比例有明顯差異，花色苷可以作為化學(xué)指紋區(qū)分 6 個(gè)不同品種的藍(lán)莓，為篩選和培育優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種提供理論支撐。

　　張瑜瑜; 用成健; 劉佳妮; 陳澤斌; 姚麗媛; 華金珠， 東北農(nóng)業(yè)科學(xué) 發(fā)表時(shí)間：2021-08-30

　　關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;花色苷;高效液相色譜;主成分分析

　　藍(lán)莓(Ericaceae Vaccinium spp.)又名藍(lán)漿果、越桔等，屬杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium. spp.)植物,為多年生落葉或常綠或小灌木[1]。世界范圍內(nèi)約有 480 余種，是世界上 4 種(草莓、樹莓、越桔、醋栗)新興小漿果類果樹之一[2]。

　　藍(lán)莓果實(shí)中花色苷含量極高，具有抗氧化、清除自由基、抗衰老等對(duì)人體健康有益的生物活性[2-8]。花色苷是一種水溶性色素，屬于類黃酮物質(zhì)，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中[4]，同時(shí)，由于羥基和甲氧基取代基團(tuán)的位置和數(shù)量不同，各類花色苷會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色[5]，這也對(duì)藍(lán)莓的顏色起到非常重要的作用。

　　不同品種、產(chǎn)地、生長(zhǎng)年份、采收期會(huì)使藍(lán)莓的花色苷種類和含量產(chǎn)生較大差異[3]。目前，大量研究主要集中在對(duì)藍(lán)莓花色苷的提取或純化[4-6]，有關(guān)藍(lán)莓中的花色苷等多酚類物質(zhì)的活性和功能的研究報(bào)道也不少[3-6]，藍(lán)莓果實(shí)總花色苷含量因品種、基因型、種植環(huán)境和氣候條件的不同而差異較大。本研究以云南澄江主栽的 6 個(gè)品種藍(lán)莓鮮果為材料，利用高效液相色譜法(HPLC)和加標(biāo)定性測(cè)定法檢測(cè)各品種成熟鮮果的花色苷組成，通過主成分分析法對(duì) 6 個(gè)品種的花色苷組成進(jìn)行差異分析，以期為篩選和培育優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種提供理論支撐。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　云南澄江主產(chǎn)的 6 個(gè)藍(lán)莓品種：夏普蘭、燦爛、密斯提、比洛克西、綠寶石、萊格西，鮮果成熟后進(jìn)行采樣，每個(gè)品種重復(fù) 3 次，每次重復(fù)隨機(jī)采樣 100 粒，樣品采集后放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存待用。

　　1.2 試劑

　　飛燕草素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、矢車菊素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、矮牽牛素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、錦葵-3-Q-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、芍藥素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)等。

　　1.3 儀器與設(shè)備

　　PL204 型精密電子天平;LC-20AB 型高效液相色譜儀;Uv-120-02 紫外分光光度計(jì);BluePard Cu420 電熱恒溫水浴鍋;Lab Tech EV311 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;循環(huán)水式真空泵;Sigma1-14 離心機(jī);

　　1.4 供試樣品花色苷提取

　　參照楊曉慧等[7]的方法稍加改進(jìn)。取適量藍(lán)莓加入少量去離子水，用勻漿機(jī)勻至泥狀，精確稱取勻漿 0.5 g，用 5 mL 含 5%甲酸的甲醇溶液超聲提取 15 min，再于 10 ℃、12000 r/min 的條件下離心 20 min，合并兩次上清液，定容至 10 mL，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)過濾后進(jìn)行液相檢測(cè)。

　　1.5 花色苷定性定量分析

　　參照楊曉慧等[7]花色苷定量方法，采用 HPLC 法測(cè)定藍(lán)莓鮮果中的花色苷的種類和相對(duì)含量，根據(jù)色譜峰保留時(shí)間，確定藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷種類的數(shù)量;再分別以飛燕草素葡萄糖苷、矢車菊素葡萄糖苷、矮牽牛素葡萄糖苷、錦葵-3-O葡萄糖苷、芍藥素葡萄糖苷為外標(biāo)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)藍(lán)莓鮮果的花色苷進(jìn)行定性和定量分析。

　　1.6 數(shù)據(jù)分析

　　采用 SPSS20.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析和主成分分析。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 不同品種藍(lán)莓果實(shí)花色苷含量

　　“比洛克西”藍(lán)莓品種果實(shí)總花色苷含量最高，為 2933.551 mg/kg，“萊格西”藍(lán)莓品種果實(shí)總花色苷含量次之，為 934.451 mg/kg，屬于富含花色苷的品種;“燦爛”、“密斯提”、“綠寶石”等 3 個(gè)藍(lán)莓品種果實(shí)總花色苷含量居中，為 475.761~684.732 mg/kg，“夏普藍(lán)”藍(lán)莓品種果實(shí)總花色苷含量最低，為 110.425 mg/kg;總花色苷含量較高的“比洛克西” 和“萊格西”是總花色苷含量最低的 “夏普藍(lán)”的 8.46~26.56 倍，見表 1。

　　芍藥素-3-O-葡萄糖苷是在“夏普藍(lán)”、“燦爛”和“密斯提”中含量最高的花色苷，其中以“燦爛”的含量最高，為 204.42 mg/kg,是”夏普藍(lán)“的 7.84倍，是“密斯提”的 1.34 倍;

　　飛燕草素-3-O-半乳糖苷在“比洛克西”中最高，為 554.408 mg/kg，是“夏普藍(lán)“的 113.65 倍;芍藥素-3-O-阿拉伯糖苷在”綠寶石“和”萊格西“中最高，是”夏普藍(lán)“的 16.64~50.45 倍;

　　2.2 不同品種藍(lán)莓花色苷組成比例

　　6 個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)花色苷組成比例圖中，“夏普藍(lán)”、“燦爛”、“密斯提”中的芍藥素-3-O-葡萄糖苷相對(duì)含量最高，占 20.76%~23.62%，在 6 個(gè)品種中變幅范圍也最大，為 10.61%~29.85%;在“比洛克西”和“萊格西”中，芍藥素-3-O阿拉伯糖苷的組成比例最大，分別為 19.80%和 26.34%，其含量是飛燕草素葡萄糖苷的 293 倍和 25.2 倍;飛燕草素葡萄糖苷的相對(duì)含量最低，為 0.06%~1.13%;所有品種的飛燕草素-3-O-半乳糖苷的相對(duì)含量都高于 10%; “萊格西”中芍藥素-3-O-阿拉伯糖苷的相對(duì)含量最高，為 26.34%，除“夏普藍(lán)”外，其余品種的芍藥素-3-O-阿拉伯糖苷的相對(duì)含量均高于 16%;“綠寶石”的飛燕草素葡萄糖苷相對(duì)含量所占比例為 3.45%，“夏普藍(lán)”和“萊格西”的飛燕草素葡萄糖苷相對(duì)含量所占比例分別為 1.13%和 1.05%，其余 3 個(gè)品種均低于 1%，見圖 1。

　　2.3 不同品種藍(lán)莓花色苷主成分分析

　　為了更好地分析 6 個(gè)不同品種的藍(lán)莓花色苷的組成，以花色苷相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析(圖 2)。由主成分分析散點(diǎn)圖(圖 2-A)可以看出，主成分 1(PC1)解釋了總方差的 84.246%，主成分 2 解釋了總方差的 14.000%，它們共同解釋了總方差的 98.246%，能夠很好的解釋變量的總體變化情況。由圖 2 可知，主成分 1 把 6 個(gè)品種分成 2 大類，一類為“夏普藍(lán)”，另一類為“燦爛”、“密斯提”、 “比洛克西”、“綠寶石”、“萊格西”等 5 個(gè)品種。主成分 2 又進(jìn)一步將這 6 個(gè)品種分在 3 個(gè)象限，其中，“燦爛”、“密斯提”、“比洛克西”、“綠寶石”4 個(gè)品種分在第 1 象限，“夏普藍(lán)”在第 2 象限，“萊格西”位于第 4 象限，“萊格西”緊鄰著主成分 2 的負(fù)坐標(biāo)軸。由此可以說明，主成分 1 和主成分 2 能將這 6 個(gè)品種明顯地區(qū)分開。

　　主成分分析的散點(diǎn)圖(圖 2-A)和載荷圖(圖 2-B)共同反映了藍(lán)莓品種與各類花色苷的對(duì)應(yīng)關(guān)系，由圖 2-B 可知，除了芍藥素-3-O-葡萄糖苷外，其余的花色苷都在 X 軸的正半軸，結(jié)合圖 2-A 可以說明，“比洛克西”中，飛燕草素-3-O半乳糖苷的貢獻(xiàn)是最大的;飛燕草素葡萄糖苷位于載荷圖第二象限，因此在主成分分析圖中可以區(qū)分出“夏普藍(lán)”這個(gè)品種。

　　3 討論

　　3.1 不同品種藍(lán)莓果實(shí)花色苷組成及含量分析

　　本研究針對(duì)花色苷類化合物具有特征吸收峰的特點(diǎn)，采用 HPLC 標(biāo)準(zhǔn)品外標(biāo)法直接對(duì)藍(lán)莓果實(shí)花色苷的粗提物進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其組成及含量進(jìn)行探討。

　　研究結(jié)果顯示，藍(lán)莓花色苷的組成及所占比例主要受藍(lán)莓的品種特征影響，但不同品種藍(lán)莓的花色苷組成和相對(duì)含量主要由遺傳因素決定[8-10]。本試驗(yàn)研究表明，在 6 個(gè)品種的藍(lán)莓成熟果實(shí)中共檢測(cè)到 10 種不同結(jié)構(gòu)的花色苷，說明所研究的 6 個(gè)品種的藍(lán)莓果實(shí)均含有非常豐富的花色苷;且芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量最高，為 26.078~476.703 mg/kg，因此，可以用作分離制備該花色苷的原料，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，芍藥素-3-O-葡萄糖苷在各品種間均是含量最高的組分，這與謝國(guó)芳[12]的檢測(cè)結(jié)果一致，但不同品種間其含量仍有較大差異(16.25%~23.62%)。

　　同時(shí)，同一種花色苷在不同品種間存在顯著差異，各種不同的花色苷在特定品種的組成是相對(duì)穩(wěn)定的，這與朱金艷[11]的研究結(jié)果大致相似的;花色苷相對(duì)含量的高低還受栽培地的生態(tài)環(huán)境、土壤質(zhì)地的影響 [12]。

　　3.2 不同品種藍(lán)莓果實(shí)的花色苷構(gòu)成及含量影響因子

　　花色苷合成酶的催化活性在一定程度上受日照條件的影響，紫外線照射可以明顯提高花色苷合成酶的催化活性[13]，因此也就間接影響花色苷含量及構(gòu)成比之間的差異。大量研究表明，植物花色苷的生成水平明顯受到光照等外界環(huán)境因子的影響。本研究的對(duì)象是 6 個(gè)品種藍(lán)莓鮮果的花色苷，種植地為云南澄江，該地處于高海拔低緯度地區(qū)，平均日照時(shí)間長(zhǎng)，紫外線輻射相對(duì)較強(qiáng)，是促進(jìn)植物合成花色苷的重要因子。由此可知，除品種差異外，日照長(zhǎng)短和紫外線強(qiáng)度等因子也是造成花色苷含量差異的原因。

　　4 結(jié) 論

　　本研究利用高效液相色譜法(HPLC)和加標(biāo)定性測(cè)定法對(duì) 6 個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)的花色苷組成和相對(duì)含量進(jìn)行探討，同時(shí)，對(duì)不同品種藍(lán)莓果實(shí)的各類花色苷進(jìn)行比較研究，并基于單體花色苷相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析。試驗(yàn)在 6 個(gè)品種的藍(lán)莓果實(shí)中共檢測(cè)到 10 種花色苷，其中，“比洛克西”果實(shí)總花色苷含量最高，為 2933.551 mg/kg，“萊格西”次之，為 934.451 mg/kg，屬于富含花色苷的品種;芍藥素-3-O-葡萄糖苷是所測(cè)品種的“夏普藍(lán)”、“燦爛”和“密斯提”中含量最高的花色苷，其中以“燦爛”的含量最高，為 204.42 mg/kg,是”夏普藍(lán)“中芍藥素-3-O-葡萄糖苷的 7.84 倍，是“密斯提”的 1.34 倍;飛燕草素-3-O-半乳糖苷的含量在“比洛克西”中最高，是“夏普藍(lán)“中飛燕草素-3-O-半乳糖苷的 113.65 倍;芍藥素-3-O-阿拉伯糖苷的含量在”綠寶石“和”萊格西“中最高，是”夏普藍(lán)中“芍藥素-3-O-阿拉伯糖苷的 16.64~50.45 倍;“夏普藍(lán)”、“燦爛”、“密斯提”中，芍藥素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)含量最高，為 20.76%~23.62%，在 6 個(gè)品種中波動(dòng)范圍也最大，為 10.61%~29.85%;主成分分析顯示不同品種藍(lán)莓單體花色苷所占比例存在明顯差異，可知，花色苷可以作為化學(xué)指紋來(lái)區(qū)分 6 個(gè)不同品種的藍(lán)莓，以期為篩選和培育優(yōu)質(zhì)藍(lán)莓品種提供理論支撐。