去氧紫草素對原代神經(jīng)元線粒體自噬的影響

　　摘要：目的 基于mt-Keima熒光蛋白研究去氧紫草素對神經(jīng)元線粒體自噬的影響。 方法 定位于線粒體上的Keima蛋白(mt-Keima)，具有pH敏感性，在中性pH和酸性溶酶體中分別被458 nm和561 nm 激光激發(fā)，反映線粒體自噬活性。分離 mt-Keima轉(zhuǎn)基因小鼠的原代皮層神經(jīng)元，用自噬抑制劑巴弗洛霉素 A1 (100 nmol·L-1 )處理mt-Keima神經(jīng)元24 h，激光共聚焦顯微鏡觀察mt-Keima蛋白在細(xì)胞內(nèi)的熒光信號并對線粒體自噬變化進(jìn)行定量分析，從而檢測mt-Keima線粒體自噬評價體系的可靠性。502個天然小分子化合物處理mt-Keima神經(jīng)元，通過高內(nèi)涵成像分析561 nm和458 nm激光下相對熒光強度;用篩選出的去氧紫草素(100 nmol·L-1 )處理神經(jīng)元24 h，激光共聚焦觀察mt-Keima蛋白的熒光變化并對線粒體自噬變化進(jìn)行定量分析;免疫熒光檢測原代神經(jīng)元線粒體外膜受體蛋白 Tom20(Mitochondrial import receptor sub? unit Tom20，Tom20)的表達(dá)，進(jìn)一步反映線粒體自噬水平的變化;四甲基若丹明甲酯染料染色后，利用激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化。結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)了mt-Keima 蛋白;與DMSO相比，100 nmol·L-1 巴弗洛霉素A1處理組mt-Keima在561 nm和488 nm 激光下的熒光強度比值下降，表明線粒體自噬水平降低(P<0.01)，此結(jié)果說明mt-Keima能夠指示線粒體自噬活性;高內(nèi)涵分析結(jié)果和激光共聚焦的驗證結(jié)果表明，與對照組相比，100 nmol·L-1 去氧紫草素處理組mt-Keima在561 nm 以及 488 nm 激光下的熒光強度比值增強，表明線粒體自噬水平增加(P<0.01);免疫熒光結(jié)果表明去氧紫草素處理后Tom20蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，誘導(dǎo)了線粒體自噬;激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示在去氧紫草素處理組，神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位無變化。結(jié)論 去氧紫草素在不造成線粒體損傷的前提下促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。

　　本文源自路丁乙; 李婷; 姚鋮鋮; 陳佳意; 趙潔; 韓秋影; 李愛玲; 潘欣， 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志 發(fā)表時間：2021-05-09《中國藥理學(xué)與毒理學(xué)》雜志，于1986年經(jīng)國家新聞出版總署批準(zhǔn)正式創(chuàng)刊，CN:11-1155/R，本刊在國內(nèi)外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強的特點，其中主要欄目有：論著、方法、綜述等。

　　關(guān)鍵詞：線粒體自噬;mt-Keima;去氧紫草素

　　神經(jīng)元主要依賴氧化磷酸化來產(chǎn)生能量，因此線粒體健康狀態(tài)對于神經(jīng)元功能至關(guān)重要[1]。線粒體自噬(mitophagy)是自噬的一種，即通過自噬方式特異性去除受損的線粒體，是維持線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鑒于神經(jīng)元的特殊功能，神經(jīng)系統(tǒng)的線粒體自噬水平非常活躍。神經(jīng)元線粒體自噬與衰老以及神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，神經(jīng)元線粒體自噬異常會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體累積，進(jìn)一步誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體過度破裂，引起細(xì)胞損傷，從而加速機體衰老進(jìn)程[2]。因此，通過藥理學(xué)方法增加或者恢復(fù)線粒體自噬作用，為延緩衰老以及治療神經(jīng)退行性疾病開發(fā)新的治療靶點，已成為研究的一大熱點[3-4]。

　　為開發(fā)潛在的促進(jìn)線粒體自噬的化合物，本研究從包含 502 個天然小分子化合物庫中篩選促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬的小分子，進(jìn)而篩選到去氧紫草素這一小分子。紫草素是從天然的中草藥紫草中提取的活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種活性[5-7]。目前尚未報道該化合物能夠促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。本實驗通過分離 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠[8](具有全身線粒體定位的 Keima 蛋白)的原代皮層神經(jīng)元，驗證了去氧紫草素能夠促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬，此研究為治療神經(jīng)退行性疾病提供了新的方向。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物、試劑和儀器

　　mt-Keima轉(zhuǎn)基因小鼠來自美國杰克森實驗室，庫存號：028072;;C57BL/6來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016- 0006。神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、N-2、B27 無血清添加劑、DMEM 高糖培養(yǎng)基都來自美國 Gibco 公司;馬血清來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;青霉素-鏈霉素雙抗、多聚賴氨酸來自中科邁晨北京科技有限公司;胰蛋白酶來自美國 Sigma 公司;Lab-Tek 八腔室、四甲基羅丹明乙酯(Tetra? methylrhodamine，TMRM)來自美國 Thermo Fisher 公司;巴弗洛霉素 A1 來自美國 Selleck 生物科技有限公司;去氧紫草素(純度 99.36%)來自上海陶素生化科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(Carbonyl cy? anide 3 - chlorophenylhydrazone，CCCP)來 自 美國 Sigma公司;線粒體外膜受體蛋白Tom20(Mito? chondrial import receptor subunit Tom20，Tom20)鼠單克隆抗體來自美國 Santa Cruz 公司;羊抗鼠 Alexa Fluor 488和 Hoechst 細(xì) 胞核染料來自美國 Thermo Fisher Scientific公司，熒光封片劑(含DAPI)來自北京中杉金橋公司;黑色96孔板來自美國Per? kin Elmer 公司。激光共聚焦熒光顯微鏡來自德國 Zeiss 公司;倒置相差顯微鏡來自日本 Nikon 公司;高內(nèi)涵成像分析儀來自美國Perkin Elmer公司。

　　1.2 神經(jīng)元的分離及培養(yǎng)

　　實驗室繁殖得到的 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠和維通利華公司購得野生型 C57BL/6孕鼠，按照本實驗已有的方法分離原代皮層神經(jīng)元[9]，分離好的神經(jīng)元種于接種液(含10%的胎牛血清、馬血清以及1% 的青霉素-鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)基)中，于 37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 6 h 后，換為神經(jīng)元培養(yǎng)基(含 2% 的 B27、1% 的 N-2、谷氨酰胺以及青霉素-鏈霉素雙抗混合液的Neurobasal 基礎(chǔ)培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，體外培養(yǎng)6~7 d可進(jìn)行實驗。

　　1.3 檢測mt-Keima熒光蛋白在原代神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)

　　分離得到的 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠的原代神經(jīng)元按照每孔 2×104 個細(xì)胞均勻種在Lab-Tek八腔室中，在體外培養(yǎng) 7 天，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發(fā)光下檢測細(xì)胞的發(fā)光情況。

　　1.4 檢測巴弗洛霉素A1對神經(jīng)元線粒體自噬的影響

　　分離得到的 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠的原代皮層神經(jīng)元，在體外分化第6天時，分別用100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(實驗組)和相同濃度的 DMSO(對照組)處理 24 h 后，將加藥后的神經(jīng)元置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發(fā)光下檢測細(xì)胞的發(fā)光情況，利用 Volocity 軟件處理拍攝后的圖像，統(tǒng)計每個細(xì)胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值表示線粒體自噬水平。

　　1.5 高內(nèi)涵篩選促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬的化合物

　　96 孔板提前 1 h 鋪上多聚賴氨酸，之后用高壓過的無菌水清洗2次，晾干待用。mt-Keima轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞按照 2×10^ 4 個每孔種于 96孔板中。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)第 6 天，每孔加入不同的天然小分子化合物(共 502 個)，處理 24 h 后，將孔板放入高內(nèi)涵儀中進(jìn)行掃描。利用高內(nèi)涵數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，計算細(xì)胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值(線粒體自噬指數(shù))用來表示線粒體自噬水平。

　　1.6 去氧紫草素促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬的檢測

　　分離得到的 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠的原代皮層神經(jīng)元，在體外分化第 6天時，分別用 100 nmol·L-1 巴弗洛霉素 A1(實驗組)和相同濃度的 DMSO(對照組)處理 24 h 后，之后將神經(jīng)元置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，在波長為 458 和 561 nm 的激發(fā)光下檢測細(xì)胞的發(fā)光情況，利用 Volocity 軟件處理拍攝后的圖像，統(tǒng)計細(xì)胞中 561 nm 熒光信號強度和 458 nm 熒光信號強度，計算比值表示線粒體自噬水平。

　　1.7 神經(jīng)元線粒體膜電位的測定

　　分離得到的 C57BL/6 野生型小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞，在體外分化第6天時，實驗組分別用100 nmol·L-1 去氧紫草素處理24 h和10 μmol·L-1 羰基氰化物間氯苯 腙(Carbonyl cyanide 3 - chlorophenylhydrazon， CCCP)處理 12 h，其中 CCCP 為線粒體解偶劑，破壞線粒體膜電位，可作為本實驗的陽性對照。處理 24 h的溶劑(DMSO)作為對照組，吸棄八腔室中的神經(jīng)元培養(yǎng)基，用神經(jīng)元培養(yǎng)基稀釋四甲基若丹明甲酯(Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM)，終濃度為 100 nmol·L-1 ，配置成 TMRM 的染色液，在 37℃孵育 30 min，孵育結(jié)束后，吸棄染色液，用 PBS緩沖液洗滌細(xì)胞一次，培養(yǎng)液換成新鮮的神經(jīng)元培養(yǎng)基，Hoechst(1∶1000)溶于 PBS 緩沖液中染核 8 min，之后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察掃描。

　　1.8 免疫熒光檢測神經(jīng)元Tom20的表達(dá)

　　將 Platinum Line Cover Glass 玻片置于 24 孔板內(nèi)，加入 300 μL 的多聚賴氨酸置于 37℃培養(yǎng)箱 1 h 后，每孔接種 4×10^ 4個 C57BL/6 野生型小鼠的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞，在體外分化第6天時，分別用 100 nmol·L-1去氧紫草素(實驗組)和相同濃度的DMSO(對照組)處理24 h。細(xì)胞用4%的多聚甲醛在37℃敷箱固定15 min(多聚甲醛需要提前預(yù)熱)，用1×PBS清洗1次，之后用含有0.3%的Triton-100 的PBS打孔10 min。用含3%羊血清的PBS(封閉液)室溫封閉 1 h 后，一抗 Tom20(1∶400)4℃ 孵育過夜，熒光二抗 Alexa Fluor 488(1∶400)室溫孵育 1 h，最后用熒光封片劑(含 DAPI )封片，室溫晾干后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

　　1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

　　使用 GraphPad Prism6.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間采用雙樣本 t檢驗分析，多組間采用單因素方差分析比較， P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 mt-Keima熒光蛋白在原代神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)

　　將分離的 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠的原代皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng) 7 天后，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞在 458 nm 激發(fā)的熒光(標(biāo)記為綠色)有很好的線粒體定位，形狀為絲網(wǎng)狀，用于指示中性胞漿中的線粒體;在 561 nm 激發(fā)下有明顯的點狀聚集(標(biāo)記為紅色)，指示進(jìn)入酸性溶酶體中的線粒體。共聚焦熒光顯微鏡觀測的結(jié)果顯示，mt-Keima熒光蛋白在原代神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)，且本底具有一定的線粒體自噬水平(圖1)。

　　2.2 mt-Keima能夠指示線粒體自噬活性

　　為驗證 mt-Keima 能夠反映線粒體自噬，使用自噬抑制劑巴弗洛霉素 A1 處理原代神經(jīng)元，在激光共聚焦熒光顯微鏡下檢測 mt-Keima 熒光信號。與DMSO組相比，巴弗洛霉素A1(100 nmol·L-1 )處理后的神經(jīng)元細(xì)胞，mt-Keima蛋白的酸性熒光信號(紅色)減弱，線粒體自噬水平(561 nm 熒光信號強度/458 nm 熒光信號強度)下降(P<0.01)。以上結(jié)果說明，mt-Keima能夠很好的指示線粒體自噬活性(圖2)。

　　2.3 去氧紫草素能夠促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬水平

　　根據(jù)高內(nèi)涵的篩選結(jié)果(圖3B)，發(fā)現(xiàn)去氧紫草素處理后，線粒體自噬水平(561 nm熒光信號強度/ 458 nm熒光信號強度)明顯高于DMSO組，提示去氧紫草素可能能夠促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。隨后對該結(jié)果進(jìn)行驗證。將分離得到的 mt-Keima轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞，給予 100 nmol·L-1 去氧紫草素處理后，與 DMSO 組相比，神經(jīng)元細(xì)胞中 mtKeima蛋白的酸性熒光信號(紅色)增強(圖3C)，指示進(jìn)入溶酶體中的線粒體增多，線粒體自噬水平(561 nm 熒光信號強度/458 nm 熒光信號強度)增加(P<0.01)。以上結(jié)果說明，去氧紫草素能夠促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。

　　2.4 去氧紫草素促進(jìn)線粒體外膜蛋白Tom20的降解

　　Tom20是線粒體外膜的標(biāo)志蛋白，在線粒體自噬過程中發(fā)生降解。免疫熒光結(jié)果表明，與對照組相比，去氧紫草素(100 nmol·L-1 )處理后的神經(jīng)元細(xì)胞Tom20蛋白水平降低(P<0.01)，表明去氧紫草素促進(jìn)線粒體的降解，線粒體自噬活性增強(圖4)。

　　2.5 去氧紫草素不影響神經(jīng)元線粒體膜電位

　　如圖5顯示，陽性對照CCCP處理后的神經(jīng)元，細(xì)胞紅色熒光信號降低，表明線粒體膜電位下降(P<0.01)。去氧紫草素處理后的細(xì)胞與 DMSO 組相比，細(xì)胞都呈現(xiàn)較強的紅色熒光，表明線粒體膜電位較高。以上結(jié)果說明，去氧紫草素不影響神經(jīng)元的線粒體膜電位。

　　3 討論

　　線粒體是細(xì)胞中的代謝中心和信號樞紐[10]，研究表明，線粒體功能障礙已經(jīng)成為多種神經(jīng)退行性疾病的的共同特征[1 1 - 1 3]，因此清除受損的線粒體，維持線粒體的正常功能，對于改善神經(jīng)退行性疾病有著重要的意義。由于神經(jīng)元的再生能力低，能量需求高，線粒體自噬活性對神經(jīng)元的健康狀態(tài)至關(guān)重要[1 4 - 1 5]。Keima具有 pH敏感性，且不易被溶酶體進(jìn)行降解的特性，目前已被應(yīng)用于檢測自噬。 Katayama 等人將線粒體定位序列與 Keima 進(jìn)行融合表達(dá)[1 0]，將 Keima定位于線粒體，用于指示線粒體自噬。Sun 等人構(gòu)建了 mt-Keima 轉(zhuǎn)基因小鼠的模型，可以在體內(nèi)更加生理地分析線粒體自噬過程[8]。本實驗分離mt-Keima轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元，經(jīng)巴弗洛霉素A1處理后，神經(jīng)元線粒體自噬被抑制，證明了mt-Keima可用于指示線粒體自噬活性。

　　靶向線粒體自噬，通過藥理學(xué)手段提高線粒體自噬水平，為干預(yù)衰老以及年齡相關(guān)的疾病提供新的途徑，也是目前研究的熱點[1 6 - 1 8]。天然化合物在自然界中廣泛存在，一般毒副作用小。目前報道誘導(dǎo)線粒體自噬的幾種天然化合物，如尿石素A、亞精胺或煙酰胺單核苷酸等，可以保護(hù)細(xì)胞并達(dá)到延緩衰老的作用[16，19-20]。然而，已報道的能夠促進(jìn)線粒體自噬的化合物能夠在臨床中得到廣泛應(yīng)用的還非常少，因此開發(fā)新的促進(jìn)神經(jīng)元線粒體自噬的化合物，具有重要的科學(xué)意義和臨床意義。基于 mtKeima 體系篩選出來的天然小分子化合物去氧紫草素能夠促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬水平，并且通過免疫熒光實驗得到了進(jìn)一步的驗證。線粒體膜電位是反映細(xì)胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)的重要參數(shù)之一，本研究發(fā)現(xiàn)在 100 nmol·L-1 去氧紫草素處理下，并不影響神經(jīng)元的線粒體膜電位，說明去氧紫草素能夠在不造成線粒體損傷的前提下促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。由于神經(jīng)元較為敏感，在高劑量去氧紫草素的處理下，神經(jīng)元會發(fā)生死亡。因此本實驗選擇了100 nmol·L-1 進(jìn)行研究，在該劑量處理下，去氧紫草素既不影響神經(jīng)元細(xì)胞的活力狀態(tài)，又能夠最大程度誘導(dǎo)線粒體自噬。

　　已知磷脂酰肌醇-3 激酶(phosphoinositide 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)/ 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamy? cin，mTOR)途徑是細(xì)胞自噬的重要通路，目前有研究表明，紫草素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬[21-22]，從而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。因此去氧紫草素促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬是否也是靶向 PI3K/AKT/ mTOR信號通路，有待進(jìn)一步的研究和探索。

　　本研究發(fā)現(xiàn)，去氧紫草素能夠安全有效地促進(jìn)神經(jīng)元的線粒體自噬。因此，去氧紫草素在延緩衰老和治療神經(jīng)退行性疾病方面可能也有著很重要的應(yīng)用前景，也為治療衰老以及年齡相關(guān)的疾病提供新的思路。