飛蝗Dpp基因在翅發育中的功能分析

　　摘要：Dpp(Decapentaplegic，Dpp)是脊椎動物和無脊椎動物中非常重要且高度保守的一個信號通路，在細胞的生長和分化等方面具有調控作用。在完全變態昆蟲中Dpp調控翅的生長發育，但對漸變態昆蟲翅發育的作用機制尚不清楚。本文以飛蝗為研究對象，根據同源性搜索識別飛蝗Dpp基因(LmDpp)，并對其編碼的氨基酸序列與不同昆蟲Dpp進行多序列比對。然后，利用RT-qPCR方法對LmDpp在五齡飛蝗不同組織及不同發育天數的翅芽進行表達特性分析，結果顯示LmDpp在五齡每天的翅芽組織中均有表達，且在多個組織中高表達。利用RNA干擾技術探討LmDpp在飛蝗翅發育中的作用，結果顯示，與對照組相比，注射LmDpp基因的dsRNA(double-strandedRNA，dsRNA)的處理組約有31%的飛蝗在蛻皮后出現翅紊亂表型。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，H&E)染色結果表明，沉默LmDpp后的翅新表皮形成異常;RT-qPCR結果顯示，沉默LmDpp后導致飛蝗翅特異表皮蛋白基因LmACP7、LmACP8和LmACP19(Adultcuticleprotein，ACP)的表達量顯著降低。上述結果表明，LmDpp可能通過調控飛蝗翅特異表皮蛋白基因的表達參與翅的發育與形成，研究結果可為Dpp在漸變態昆蟲翅發育中的作用機制研究提供基礎。

　　武兆辰; 張福斌; 徐子龍; 張晶; 張建珍; 趙小明， 山西大學學報(自然科學版) 發表時間：2021-09-17

　　關鍵詞：飛蝗;翅發育;Dpp;RNA干擾

　　0引言

　　昆蟲是無脊椎動物中唯一有翅的動物。飛行使得昆蟲在覓食、繁殖、遷移以及躲避敵害等方面占據很大的優勢，這也是昆蟲種類和數量繁多的主要原因之一。昆蟲翅的生長發育受到多個信號通路以及一系列復雜基因的調控。

　　Decapentaplegic(Dpp)屬于轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)超家族，是脊椎動物骨形態發生蛋白(bonemorphogenet?icprotein，BMP)的同源物，且在物種間具有保守性。Dpp在昆蟲生長發育的多種細胞和分子過程中發揮著多種作用，類似于生長分化因子(growthanddifferentiationfactors，GDFs)、激活素(Activin)和節點素(Nodal)[1]。目前，在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中對昆蟲Dpp基因功能研究最為深入。在果蠅胚胎發育的早期階段，Dpp主要參與胚胎間隔的形成和背腹軸的分化[2]。隨后，研究發現Dpp與Hedgehog和Wingless信號通路協作，通過Dpp不同濃度梯度的存在，作為一種形態因子，決定了包括翅、足和觸角在內的附著物的位置和分化[3-4]。此外，先前研究報道表明，Dpp在卵子發生中起重要作用，并與前端卵殼結構形成模式有關[5]。Dpp還可以通過促進視網膜下膠質細胞的增殖和運動來促進眼睛的發育[6-7]。

　　關于Dpp在昆蟲翅發育中的研究同樣主要集中在黑腹果蠅，而在其他昆蟲中的研究報道較少。例如，在果蠅翅原基發育過程中，Dpp在前后腔室邊界中央條紋形成不同的濃度閾值，并以劑量依賴的方式調節下游基因的表達水平[8-9]。隨后，Dpp通過控制正在發育的翅中細胞的生長和增殖速率來決定最終的翅大小[9-10]。在果蠅中，Dpp沿翅脈高量表達，其功能的喪失導致脈序的部分缺失或不完全發育[11-12]。與果蠅類似，黃翅菜葉蜂(Athaliaro?sae)的Dpp基因在前翅和后翅均有廣泛表達，Dpp基因敲除導致翅脈發育完全缺失[13]。此外，Dpp還參與了小地老虎(Agrotisipsilon)翅芽的再生[14]。綜上所述，Dpp參與昆蟲翅發育進程，在不同物種間其作用具有相似性，但作用方式略有不同。

　　飛蝗(Locustamigratoria)是一種不完全變態昆蟲，也是一種重要的作物害蟲，主要為害禾本科植物。目前，針對Dpp在昆蟲生長發育中的研究，尤其在翅發育中的研究，主要集中在以黑腹果蠅為代表的完全變態昆蟲中，然而Dpp在漸變態昆蟲翅發育中的作用機制尚不清楚。本文以飛蝗為實驗對象，基于飛蝗翅轉錄組數據庫搜索獲得Dpp基因cDNA序列，并進行特征分析;通過RT-qPCR技術檢測LmDpp基因在5齡飛蝗若蟲中的時空表達模式，通過RNA干擾技術結合蘇木精-伊紅(Hematoxylineosin，H&E)染色分析LmDpp的生物學功能，為Dpp在漸變態昆蟲翅發育中的作用機制研究提供基礎。

　　1材料與方法

　　1.1實驗材料

　　將保存于本實驗室昆蟲飼養室的飛蝗蟲卵置于人工氣候箱中孵化，孵化后轉移至干凈的紗籠中，然后在溫度為(30±2)℃，濕度為(40±10)%的飼養室中用新鮮的小麥飼養，到達三齡后添加少許麥麩進行飼養，長至五齡后進行不同組織部位和不同發育天數翅芽取材以及其他實驗。

　　1.2實驗試劑

　　RNA提取試劑(RNAisoPlus)購于大連寶生物公司(TaKaRa);雙鏈RNA合成試劑盒購于Promega公司;ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix，HiScript?ⅢRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper)購于南京諾唯贊生物科技有限公司;膠回收試劑盒購于天根公司(TIAN?GEN);其他相關試劑購置于生工生物工程(上海)股份有限公司(SangonBiotech)。

　　1.3實驗方法

　　1.3.1飛蝗Dpp基因獲取及氨基酸序列比對

　　根據飛蝗翅轉錄組數據庫，以黑腹果蠅Dpp基因(CG9885)cDNA序列進行同源性搜索，獲得飛蝗Dpp基因(LmDpp)的cDNA序列。利用Translatetool(https：//web.expasy.org/translate/)將LmDppcDNA序列翻譯成氨基酸序列;在NCBI網站對LmDpp序列進行BLAST分析并下載黑腹果蠅、德國小蠊(Blattellager?manica)、內達華白蟻(Zootermopsisnevadensis)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、棉鈴蟲(Heli?coverpaarmigera)的Dpp氨基酸序列，利用GENEDOC軟件進行氨基酸序列比對分析。

　　1.3.2LmDpp表達特性檢測

　　摘取五齡若蟲飛蝗每一天(第1-8天，N5D1-N5D8)的翅芽(Wingpads，WP)組織，同時挑選發育整齊的五齡第6天的飛蝗，摘取其不同組織，包括足(Leg，LE)、體壁(Integu?ment，IN)、翅芽(WP)、脂肪體(Fatbody，FB)、前腸(Foregut，FG)、中腸(Midgut，MG)、后腸(Hindgut，HG)、胃盲囊(Gastriccaeca，GC)、精巢(Testis，TE)和卵巢(Ovary，OV)。利用RNAisoPlus提取不同組織和不同時期樣品的總RNA，并稀釋到0.5μg/μL。置于-80℃冰箱保存。接著按照反轉錄試劑盒中的說明書取1μL總RNA進行cDNA的合成。再通過PrimerPremier5.0軟件設計LmDpp基因和RPL-32內參基因的特異性熒光定量引物(表1，由上海生工公司合成)，利用RT-qPCR的方法檢測LmDpp在不同組織和不同發育時期的表達情況，不同組織和發育時期均設置四個重復試驗。最后LmDpp的相對表達量用2-ΔΔCt法進行分析。

　　1.3.3LmDpp基因雙鏈RNA合成及RNA干擾

　　根據LmDpp基因序列設計并合成含有T7啟動子序列的RNA干擾(RNAinterference，RNAi)引物(表1，上海生工公司合成)，以五齡飛蝗的cDNA為模板進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過膠回收回收目的條帶，并測定回收產物的濃度。取1μg的膠回收產物為模板進行dsRNA的合成，將合成的dsRNA定量到2μg/μL，接著瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，置于-20℃保存。選取五齡第1天飛蝗38頭，雌雄比例約為1：1，用微量注射器將Lm?DppdsRNA(dsLmDpp)注射于飛蝗體腔。每頭注射5μL，即10μg。再選取41頭飛蝗，注射等量的dsGFP作為對照組。分開飼養，分別喂食新鮮的小麥，飼養至五齡第6天分別取對照組和處理組飛蝗翅芽組織進行總RNA提取、反轉錄，RT-qPCR方法檢測沉默效率。剩余飛蝗繼續飼養并進行表型觀察。

　　1.3.4H&E染色及翅表皮蛋白基因表達檢測

　　根據1.3.3中RNAi結果，重復挑選五齡第1天的飛蝗分別注射dsLmDpp與dsGFP，新鮮小麥飼養，在蛻皮前(N5D7)各取對照組和處理組飛蝗翅芽組織，一部分提取RNA檢測沉默效率，另一部分3%戊二醛固定后送到武漢塞維爾生物公司進行石蠟切片和蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，H&E)檢測。根據課題組前期研究基礎，選取沉默效率顯著的3組處理組飛蝗，利用RT-qPCR檢測LmDpp沉默后對飛蝗翅特異表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8和LmACP19)表達的影響，以RPL32為內參基因，每組設置兩個技術重復，檢測結果用2-ΔΔCt法進行分析，引物如表1。

　　1.3.5數據分析

　　LmDpp基因在不同發育天數和不同組織中的表達、LmDpp沉默效率以及LmDpp沉默后翅表皮蛋白基因的相對表達量均采用2-ΔΔCt方法進行分析，并采用Studentt-test方法進行差異表達分析(*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01和***P<0.001表示差異極顯著)。

　　2結果與分析

　　2.1LmDpp序列比對分析

　　根據黑腹果蠅Dpp基因cDNA序列進行同源搜索，識別了飛蝗LmDppcDNA序列，該基因編碼蛋白含有一個TGFβ_propeptide和TGFβ結構域，多序列比對分析發現TGFβ_propeptide在物種間保守性較低，而TGFβ結構域相似性較高(圖1)。

　　2.2LmDpp在五齡不同組織和不同發育時期的表達模式

　　利用RT-qPCR檢測LmDpp在五齡飛蝗不同發育天數翅芽組織中的表達，結果顯示，Lm?Dpp在第1天到第8天都有較高的表達量(N5D1-N5D8);不同組織中的表達結果顯示，LmDpp在多個組織中都有表達，如足、體壁、翅芽、脂肪體、前腸、后腸、精巢、卵巢，其中Lm?Dpp在足、體壁、前腸中高表達(圖2)。

　　2.3LmDpp在飛蝗中的生物學功能分析

　　選取五齡第1天的飛蝗進行dsLmDpp的注射，同時注射等量的dsGFP作為對照。繼續飼養至第6天，取飛蝗翅芽提取總RNA，RT-qP?CR檢測LmDpp的沉默效率。結果顯示，與對照組相比，注射dsLmDpp的處理組飛蝗中Lm?Dpp表達量極顯著下降(圖3A)，沉默效率達到77.8%。對飛蝗的表型進行觀察，結果顯示，對照組飛蝗均能正常蛻皮至成蟲，注射dsLmDpp的飛蝗雖能夠成功蛻皮但約有31%的成蟲出現翅型紊亂的表型，具體表現為前后翅無法正常閉合、皺縮卷曲(圖3B)。

　　2.4LmDpp影響飛蝗翅表皮發育

　　為了進一步探討LmDpp如何影響飛蝗翅發育，在沉默LmDpp表達后，摘取蛻皮前(N5D7)翅芽組織進行石蠟切片和H&E染色分析，以注射dsGFP的飛蝗翅芽為對照。H&E染色結果顯示，對照組中蛻皮前翅芽舊表皮發生降解，形成大量新表皮并產生折疊，上下兩層新表皮間形成空腔，蛻皮后發育成成蟲翅膜和翅脈，而處理組中翅芽舊表皮正常降解，翅新表皮能夠折疊但形成異常、無法正常排列形成空腔和正常表皮結構(圖4A，B);通過RT-qPCR技術檢測飛蝗翅表皮蛋白基因的表達，結果顯示，與對照組相比，處理組中LmACP7、LmACP8和LmACP19的表達顯著下降(圖4C)。

　　3討論

　　昆蟲翅形態的多樣性是昆蟲種群生長發育的重要原因之一。Dpp信號通路是一個高度保守的信號通路，調節細胞生長和分化等。在完全變態昆蟲果蠅中，Dpp在胚胎發育和成蟲附肢的形成中起著成形素(morphagen)的作用。如在翅成蟲盤中，通過DPP濃度梯度依賴的方式誘導不同基因的區域表達來控制前、后成蟲盤的形成[15]。另外，在果蠅背板愈合中線處抑制Dpp信號通路的受體或其信號因子均可以引起嚴重的背板愈合缺陷現象[16]。近年來，大量研究表明，Dpp基因可以在各種昆蟲的翅發育中發揮相同、相似甚至不同的作用，這可能與昆蟲發育方式相關。

　　飛蝗是典型的漸變態昆蟲，翅在其遷飛、覓食和躲避敵害等方面具有重要作用。本文根據黑腹果蠅Dpp基因編碼序列，基于飛蝗翅轉錄組數據庫，通過同源搜索獲得飛蝗Dpp基因編碼序列。與其他昆蟲類似，LmDpp基因編碼蛋白含有一個TGFβ_propeptide和TGFβ結構域，其中TGFβ結構域氨基酸序列與完全變態昆蟲(如黑腹果蠅、棉鈴蟲、亞洲玉米螟等)相似性較高(圖1)，暗示其功能具有保守性。在漸變態昆蟲褐飛虱(Nilaparvatalu?gens)翅發育過程中，NlDpp主要負責翅脈的形成，NlDpp的沉默導致長翅型和短翅型褐飛虱前翅和后翅的翅脈完全消失[17]，這種表型與在黃翅菜葉蜂中沉默Dpp的表型相同[13]。在果蠅翅中過表達Dpp導致額外翅脈的發育[18]，而Dpp的缺失導致翅脈的部分喪失[11-12]。上述結果表明，Dpp可能在一定程度上保留了其在昆蟲翅脈發育中的功能。昆蟲翅由翅脈和翅膜構成，其來源于外胚層，具有表皮結構。在飛蝗中，沉默LmDpp后導致飛蝗翅發育異常，翅表現出卷曲、皺縮的表型(圖3)。H&E染色結果顯示，沉默LmDpp后飛蝗翅表皮發育異常，新表皮無法正常形成(圖4A，B)，表明LmDpp在飛蝗翅表皮形成中具有重要作用。飛蝗五齡若蟲新形成的表皮蛻皮后將發育成成蟲翅(由翅脈和翅膜構成)，沉默LmDpp影響上下兩層新表皮間空腔的正常形成，可能導致成蟲翅脈和翅膜無法正常形成，進而導致成蟲翅出現皺縮卷曲現象。

　　在褐飛虱中，RNAi介導的NlDpp表達沉默可以顯著改變多個翅發育基因的表達[17]，表明在Dpp調控翅形成的過程中，需要多個下游基因協同參與。例如，Dpp信號通路可以調控Spaltmain(Salm)和Spalt-Related(SalR)編碼的鋅指轉錄因子控制果蠅翅成蟲盤的形成[19]。課題組前期研究發現，表皮蛋白基因LmACP7，LmACP8和LmACP19在飛蝗翅中特異表達[20]，其中LmACP7的表達缺失引起翅表皮細胞排列發生紊亂、細胞連接被破壞，從而引發線粒體途徑介導的細胞凋亡[21];而RNA干擾另一個翅表皮蛋白基因LmACP8的表達量，導致飛蝗從若蟲到成蟲的翅形態發生異常[22]。本文中干擾LmDpp的表達引起LmACP7，LmACP8和LmACP19的表達顯著下降(圖4C)，結果表明LmDpp可能通過調控飛蝗翅表皮蛋白基因的表達進而控制翅表皮的形成。然而，LmDpp基因如何調控下游靶標基因的表達進而控制翅發育需要進一步研究。本文研究結果為Dpp基因在漸變態昆蟲翅發育中的具體作用機制研究提供了基礎。