轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳營(yíng)養(yǎng)成分及食用安全研究

　　摘要 [目的]探究轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳的營(yíng)養(yǎng)成分差異，以及重組人溶菌酶的食用安全性。[方法]通過測(cè)定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因組 2 種乳樣乳常規(guī)、氨基酸和脂肪酸的含量，比較其成分差異。通過大鼠、小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)以及模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)重組人溶菌酶的食用安全性。[結(jié)果]營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳相比，細(xì)菌總數(shù)偏高，脂肪含量偏低，其他營(yíng)養(yǎng)成分無明顯的變化; 食品安全評(píng)估說明重組人溶菌酶屬于實(shí)際無毒蛋白，且無潛在的致敏性。[結(jié)論]該試驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳的食用安全性。

　　本文源自程靜然; 宋榮榮; 戴蘊(yùn)平; 趙春江， 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 發(fā)表時(shí)間：2021-06-08

　　關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因牛; 重組人溶菌酶; 牛乳; 營(yíng)養(yǎng)成分; 食用安全性

　　人溶菌酶( lysozyme) 是一種存在于人體正常體液及組織中的堿性多肽，由 130 個(gè)氨基酸組成，對(duì)生物體的自身防御起著重要作用[1]。人乳中溶菌酶的含量高、活性強(qiáng)，也是人乳不易敗壞的主要原因。人乳中溶菌酶含量約 0.5 mg /mL，比牛、綿羊和山羊乳含量高出 1 500～4 000 倍，破壞和溶解細(xì)菌的能力約為牛乳的 300 倍，是人乳中的重要抗菌因子，也是動(dòng)物乳“人乳化”的主要研究對(duì)象。人乳中的溶菌酶可破壞大多數(shù)革蘭氏陽性菌和少量陰性菌的細(xì)胞壁[2-3]，有利于嬰兒腸道正常菌群的建立和提高抗病能力。隨著對(duì)奶制品消費(fèi)需求的增加，奶制品的品質(zhì)也越來越受到人們的關(guān)注。利用乳腺生物反應(yīng)器的方法表達(dá)重組人溶菌酶，使生產(chǎn)出的奶含有高抑菌活性的溶菌酶，既有營(yíng)養(yǎng)功能，又有藥用功能[4]。隨著對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究越來越廣泛，人們?cè)絹碓街匾曓D(zhuǎn)基因制品的安全性。筆者以先前成功獲得的轉(zhuǎn)人溶菌酶基因奶牛為研究對(duì)象，通過與普通奶牛( 非轉(zhuǎn)基因牛) 對(duì)照的方式，探明轉(zhuǎn)基因牛乳與普通牛乳的營(yíng)養(yǎng)成分及代謝組差異，并對(duì)重組人溶菌酶進(jìn)行了毒理學(xué)試驗(yàn)，進(jìn)一步探究重組人溶菌酶的安全性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 乳樣采集自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地的 1 頭轉(zhuǎn)人溶菌酶奶牛和 3 頭非轉(zhuǎn)基因奶牛。重組人溶菌酶由轉(zhuǎn)基因奶牛乳中純化得到。

　　1.2 方法

　　1.2.1 牛乳營(yíng)養(yǎng)成分分析。牛乳營(yíng)養(yǎng)成分分析方法見表 1。

　　1.2.2 牛乳代謝組。乳樣離心( 4 ℃，3 000 r/min，5 min) ，棄沉淀。上清液離心( 4 ℃，12 000 r/min，15 min) ，棄沉淀，重復(fù) 3 次。吸取 100 μL 上清液，加入新的 1.5 mL EP 管中，并加入 350 μL 預(yù)冷甲醇。加入 10 μL 核糖醇，漩渦 30 s，冰水浴 5 min，離心( 4 ℃，12 000 r/min，15 min) 。將上清液在真空壓縮器中干燥，將 80 μL 氧胺鹽試劑加入干燥后的代謝物中，攪拌混勻，在 80 ℃烘箱中孵育 30 min。加入100 μL BSTFA，70 ℃進(jìn)行孵育 1.5 h，隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)。結(jié)合數(shù)據(jù)庫 LECO-Fiehn-Rtx5，通過 ChromaTOF( v4.3x，LECO) 軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

　　1.2.3 重組人溶菌酶急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。

　　1.2.3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》( GB 15193.3—2014) 進(jìn)行重組人溶菌酶的大鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果并且以霍恩氏法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì) 4 個(gè)劑量組，劑量分別為2 150、4 640、 10 000 和 21 500 mg /kg。按照體重隨機(jī)二步法對(duì)大鼠進(jìn)行分組，雌、雌大鼠各 2 組，每組各 10 只大鼠。

　　在灌胃之前，大鼠需要進(jìn)行 16 h 禁食，飲水自由。重組溶菌酶灌胃大鼠時(shí)，需要分 2 次進(jìn)行，間隔時(shí)間為 4 h，之后再進(jìn)行 3 h 禁食，連續(xù)進(jìn)行 14 d 的觀察。重組人溶菌酶灌胃大鼠之后，需要對(duì)大鼠的臨床情況進(jìn)行觀察和記錄( 如中毒情況、死亡情況等) ，觀察終點(diǎn)為灌胃后第 14 天。觀察期間，及時(shí)對(duì)死亡大鼠進(jìn)行尸體解剖及組織病理學(xué)檢查。試驗(yàn)終點(diǎn)后，對(duì)所有試驗(yàn)大鼠進(jìn)行脫頸椎處死，并進(jìn)行全身解剖進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

　　試驗(yàn)結(jié)束時(shí)統(tǒng)計(jì)不同性別大鼠的存活數(shù)量、中毒癥狀的嚴(yán)重程度和可逆性、死亡、存活及解剖檢查中各種病變的發(fā)生頻率。分別計(jì)算上述各因素的發(fā)生率和灌胃第 0、7、14 天的平均體重和標(biāo)準(zhǔn)差。

　　1.2.3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》( GB 15193.3—2014) 進(jìn)行重組人溶菌酶的小鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果并且以霍恩氏法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì) 4 個(gè)劑量組，劑量分別為4 640、10 000、 21 500 和 46 400 mg /kg。按照體重隨機(jī)二步法將小鼠進(jìn)行分組，雌、雌小鼠各 2 組，每 2 組各 10 只小鼠。在灌胃之前，小鼠需要進(jìn)行 6 h 禁食，飲水自由。4 640、10 000、21 500 mg /kg 劑量組一次性灌胃小鼠，46 400 mg /kg 劑量組分 2 次灌胃小鼠，間隔時(shí)間為 4 h，之后再進(jìn)行 1 h 禁食，連續(xù)進(jìn)行 14 d 的觀察。觀察、記錄和統(tǒng)計(jì)方法同“1.2.3.1”。

　　1.2.4 重組人溶菌酶模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)。依據(jù)《轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品食用安全性檢測(cè)模擬胃腸液外源蛋白質(zhì)消化穩(wěn)定性試驗(yàn)方法》( 農(nóng)業(yè)部 869 號(hào)公告-2-2007) 進(jìn)行試驗(yàn)。

　　按照 19 ∶1( V/V) 的比例將模擬胃( 腸) 液與重組溶菌酶樣品溶液( 對(duì)照樣品或受試蛋白) 進(jìn)行混合，并且進(jìn)行快速旋渦振蕩混勻，在 37 ℃下進(jìn)行水浴并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)。分別在 0、15 s 和 2、30、60 min 時(shí)，迅速轉(zhuǎn)移 200 μL 反應(yīng)液至 1.5 mL 離心管 ( 含有碳酸氫鈉溶液) 中。再加蛋白上樣緩沖液 70 μL，進(jìn)行 5 min 沸水浴，在室溫下冷卻，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，將電泳后的凝膠進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色，脫色，待條帶變清晰，取出凝膠并對(duì)圖像進(jìn)行保存。分別用模擬的胃、腸液對(duì)樣品進(jìn)行消化，消化后的蛋白進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行蛋白印跡，并 保 存圖像。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 牛乳營(yíng)養(yǎng)成分分析 轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定主要包括乳常規(guī)、16 種氨基酸、25 種脂肪酸的測(cè)定。

　　2.1.1 乳常規(guī)。乳常規(guī)的測(cè)定包括乳中水分、乳糖、蛋白質(zhì)總量以及體細(xì)胞和細(xì)菌總數(shù)。比較轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗(yàn)組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的乳常規(guī)測(cè)定值，由表 2 可知，這 2 組的水分、乳糖、蛋白質(zhì)含量以及體細(xì)胞的數(shù)量均無明顯變化，而試驗(yàn)組的脂肪含量低于 CK( P>0.05) ，其細(xì)菌總數(shù)則高于 CK( P>0.05) 。

　　2.1.2 乳中氨基酸。對(duì)轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗(yàn)組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的 16 種氨基酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖 1。從圖 1 可見，這 16 種氨基酸除了脯氨酸( Proline) 、丙氨酸( Alanine) 含量略有差異外，其他氨基酸含量接近或者相同，這 16 種氨基酸含量在 2 組間總體上差異不顯著( P>0.05) 。

　　2.1.3 乳中脂肪酸。對(duì)轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳( 試驗(yàn)組) 和非轉(zhuǎn)基因牛乳( CK) 的牛乳中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸共 25 種脂肪酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖 2。從圖 2 可以看出，除了飽和脂肪酸 C14 ∶0、C16 ∶0、C18 ∶0以及不飽和脂肪酸 C18 ∶ln9c 在 2 組之間存在差異，其他脂肪酸則在 2 組之間則無明顯變化，說明脂肪酸含量在 2 組間總體上差異不顯著( P>0.05) 。

　　2.2 轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳代謝組結(jié)果與分析 基于 GC-TOF- MS 平臺(tái)在轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳與非轉(zhuǎn)基因牛乳組( CK) 總共檢測(cè)出 472 種代謝物，對(duì)所有的代謝組進(jìn)行主成分分析，從圖 3 發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和 CK 并沒有明顯的聚類現(xiàn)象，且 2 組之間沒有顯著差異( P>0.05) 。

　　2.3 重組人溶菌酶急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

　　2.3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。給予大鼠重組人溶菌酶處理后，2 150 mg /kg 組和 4 640 mg /kg 組大鼠均未見明顯中毒癥狀，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)未見有死亡的大鼠。在 10 000 mg /kg 劑量組，大鼠在最后一次灌胃后出現(xiàn)活動(dòng)減少和精神不適癥狀。共死亡 6 只大鼠，其中雌、雄各 3 只。在觀察終點(diǎn)，存活 4 只大鼠，其中雌、雄各 2 只。21 500 mg /kg 劑量組大鼠在第 1 次灌胃后出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡的癥狀，末次灌胃后 1 h 開始有死亡大鼠，24 h 內(nèi)全部死亡。觀察期間，對(duì)死亡大鼠進(jìn)行大體解剖，主要觀察到胃發(fā)生腫脹，其他主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯異常。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)處死的大鼠進(jìn)行解剖，未發(fā)生明顯的毒理學(xué)變化。

　　觀察期內(nèi)動(dòng)物體重呈增長(zhǎng)相。 至 觀 察 終 點(diǎn) 時(shí)， 10 000 mg /kg劑 量 組 雌、雄性大鼠死亡率均為 60%; 21 500 mg /kg劑量組大鼠全部死亡，死亡率 100%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，重組人溶菌酶的大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的雌雄 LD50 均為9 260 mg /kg，95% MNDG 可 信 區(qū) 間 為 6 360 ～ 13 500 mg /kg [5]。

　　2.3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。給予小鼠重組人溶菌酶處理后，4 640 mg /kg 劑量組未發(fā)現(xiàn)明顯中毒癥狀及死亡的小鼠; 10 000 mg /kg 劑量組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡等癥狀，24 h 內(nèi)雌、雄小鼠各有 1 只死亡，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，雌、雄小鼠各有 4 只存活。21 500 mg /kg 劑量組，小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡等癥狀，1 h 后出現(xiàn)死亡，在 24 h 內(nèi)所有受試小鼠出現(xiàn)死亡。46 400 mg /kg 劑量組，小鼠首次灌胃重組人溶菌酶后出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡等癥狀，1 h 后出現(xiàn)死亡，4 h 后最后一次灌胃重組人溶菌酶，在 24 h 內(nèi)所有受試小鼠死亡。觀察期間，小鼠尸體解剖觀察到胃腫脹，其他主要器官未發(fā)現(xiàn)明顯異常。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠死亡后的尸體解剖未發(fā)現(xiàn)明顯的毒理學(xué)變化。

　　觀察 期 內(nèi) 動(dòng) 物 體 重 呈 增 長(zhǎng) 相。至 觀 察 終 點(diǎn) 時(shí)， 10 000 mg /kg劑量組，雌、雄小鼠各有 1 只死亡，死亡率均為 20%; 21 500 mg /kg 劑量組，小鼠全部死亡，死亡率 100%; 至觀察終點(diǎn)時(shí) 46 400 mg /kg 劑量組，小鼠全部死亡，死亡率 100%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)計(jì)算，重組人溶菌酶的小鼠急性經(jīng)口毒性雌 雄 LD50 為 12 600 mg /kg，95% 可 信 區(qū) 間 為 9 260 ～ 17 100 mg /kg。

　　2.4 模擬胃腸液消化穩(wěn)定性

　　2.4.1 模擬胃腸液試驗(yàn)。SDS-PAGE 顯示( 圖 4) ，在模擬的胃液中重組人溶菌酶及其可見降解片段在 2～30 min 內(nèi)全部消化( 3～7 孔道) 。蛋白免疫印跡結(jié)果( 圖 5) 顯示，重組人溶菌酶及其可見降解片段在模擬胃液( 4～8 孔道) 中 2～30 min 內(nèi)全部消化。

　　2.4.2 重組人溶菌酶模擬腸液消化試驗(yàn) 。SDS-PAGE 結(jié)果顯示( 圖 4) ，在模擬腸液中重組人溶菌酶及其可見降解片段在 0～15 s 內(nèi)全部消化( 11～15 孔道) 。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示( 圖 6) ，重組人溶菌酶及其可見降解片段在模擬腸液( 4～8 孔道) 中 0～15 s 內(nèi)全部消化。

　　3 結(jié)論與討論

　　在乳常規(guī)方面，轉(zhuǎn)基因牛乳的水分、乳糖、蛋白質(zhì)含量和體細(xì)胞數(shù)等與非轉(zhuǎn)基因組無明顯變化，但脂肪含量試驗(yàn)組低于 CK，菌落總數(shù)高于對(duì)照組; 轉(zhuǎn)基因牛乳中所測(cè)的 16 種氨基酸及 25 種脂肪酸含量在 2 組之間無明顯差異。在牛乳代謝組方面，轉(zhuǎn)人溶菌酶牛乳和非轉(zhuǎn)基因牛乳無明顯差異。

　　Laible 等[6]研究表明，牛乳的乳成分容易發(fā)生變化。楊鵬華等[7]關(guān)于人乳鐵蛋白基因?qū)εＨ槌煞钟绊懙难芯拷Y(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因牛乳與常乳在乳脂、總蛋白、乳糖和干物質(zhì)的含量上無明顯變化，且外源蛋白的表達(dá)水平穩(wěn)定。

　　毒理學(xué)研究決定是否能夠?qū)⑿滤帒?yīng)用于臨床，并提供有關(guān)藥物的毒性劑量和治療指數(shù)的信息。同時(shí)科學(xué)、道德和法規(guī)要求在將任何潛在的新藥供人類使用之前，必須在動(dòng)物中研究其安全性以定義安全的人類劑量[8]。溶菌酶在醫(yī)藥、食品行業(yè)以及畜牧領(lǐng)域都有著比較廣泛的應(yīng)用[9]，而轉(zhuǎn)基因得到的重組人溶菌酶在投入應(yīng)用之前，則需要進(jìn)行毒理學(xué)方面的試驗(yàn)，為今后的應(yīng)用提供試驗(yàn)支持。食品安全是指符合人體的營(yíng)養(yǎng)需求，且不會(huì)對(duì)人體健康造成急性、亞慢性和慢性危害[10]。該研究通過大鼠和小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，重組人溶菌酶屬于實(shí)際無毒蛋白; 重組人溶菌酶模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，重組人溶菌酶在胃腸液中都可消化。

　　周興華[11]對(duì)轉(zhuǎn)雙反義分支酶基因大米的急性毒性試驗(yàn)研究表明，轉(zhuǎn)基因大米的 LD50>21.50 g /kg，試驗(yàn)期間，動(dòng)物狀態(tài)良好，無死亡和異常現(xiàn)象。因此，轉(zhuǎn)雙反義分支酶基因大米屬無毒級(jí)別。

　　根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》( GB 15193.3—2014) 急性毒性( LD50 ) 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，大鼠和小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)表明，重組人溶菌酶是一種實(shí)際無毒蛋白。模擬胃腸液消化穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，重組人溶菌酶在模擬的胃液中可消化，在模擬的腸液中極易消化，初步說明重組人溶菌酶無潛在的致敏性。