硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法建立

　　【摘要】 目的 建立硝酸咪康唑搽劑微生物限度檢查法。方法 測(cè)定硝酸咪康唑搽劑對(duì)大腸埃希菌等5種試驗(yàn)菌的回收率，對(duì)2個(gè)控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 用薄膜過(guò)濾法和0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑檢查本品的細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)，其試驗(yàn)菌回收率均達(dá)到70%以上。同樣用該方法檢查本品的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，其試驗(yàn)組呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。結(jié)論 用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80-pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗劑可以消除硝酸咪康唑搽劑在試驗(yàn)條件下的抑菌作用，從而順利檢出該品種所污染的各種微生物。

　　【關(guān)鍵詞】 硝酸咪康唑搽劑;微生物限度檢查;方法學(xué)驗(yàn)證;醫(yī)學(xué)期刊投稿

　　Abstract:Objective To establish a method of microbial limit test for miconazole nitrate liniment. Methods Centrifugal sedimentation and culture medium diluted method were used to validate the accuracy and feasibility of microbial limit test.Results The recovery of bacteria, yeast and mould were above 70%. P. aeruginosa and S.aureus were positive and Gramnegative organisms were negative. Conclusions Membrane filtration and the polysorbate 80 sodium chloridepeptone buffer can be used to test the total viable aerobic count and specifiedorganisms (include S. aureus and P. aeruginosa) for miconazole nitrate liniment.

　　Key words:miconazole nitrate liniment;microbial limit test;method validation

　　微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定制劑及原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、真菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查[1]。但具有抑菌成分的藥品由于其抑菌活性的干擾，常規(guī)檢查結(jié)果不能真實(shí)地反映出藥品中污染微生物的情況，必須先消除供試品中的抑菌活性，再根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查，并必須對(duì)所采取的檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)抑菌活性的消除和檢查方法的可靠性。具有抑菌作用的藥品，每個(gè)品種抑菌效果不同，因此適合各個(gè)品種的微生物限度檢查法也不同。

　　作者曾用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過(guò)濾法(用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗)對(duì)硝酸咪康唑搽劑進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均不能達(dá)到藥典要求。吐溫80是親水性表面活性劑，具有增溶作用，因此本文選擇用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液做沖洗劑檢查該藥品的細(xì)菌、真菌、酵母菌數(shù)和控制菌，結(jié)果滿意，可為同類藥品的微生物限度檢查法提供科學(xué)依據(jù)。

　　1材料

　　1.1菌種大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44 102], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003], 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63 501], 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10 104]白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 980011], 黑曲霉(Asperg illus niger)[CMCC(F) 98003]，由廣東生物研究所提供，菌種代數(shù)均為第3代。

　　1.2培養(yǎng)基及試劑pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液、營(yíng)養(yǎng)肉湯、改良馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂、二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑、PDP瓊脂培養(yǎng)基、三氯甲烷、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基和革蘭氏染色劑。

　　1.3樣品硝酸咪康唑搽劑，阿特維斯(佛山)制藥有限公司，批號(hào)：0606950，成分：硝酸咪康唑、玫瑰麝香香精、乙醇、二甲基亞砜。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1菌液制備[1]

　　2.1.1取經(jīng)37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌與大腸埃希菌的肉湯培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.1.2取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋并制成每1 mL中含菌數(shù)50～100 cfu的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.1.3接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)。

　　2.2供試液的制備[2]取本品10 mL，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。

　　2.3驗(yàn)證方法

　　2.3.1細(xì)菌、真菌和酵母菌計(jì)數(shù)法回收率的測(cè)定

　　薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，3次獨(dú)立平行試驗(yàn)結(jié)果的均值見(jiàn)表1[3]。

　　①試驗(yàn)組：取供試液10 mL到薄膜過(guò)濾器中,用無(wú)菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖溶液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后1次沖洗液中加入1 mL的試驗(yàn)菌液(50～100 cfu/mL)沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上，置30～35 ℃培養(yǎng)48 h或23～28 ℃培養(yǎng)72 h。記錄菌落數(shù)。試驗(yàn)組的菌回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%。

　　②菌液組[4]：在過(guò)濾器中預(yù)先加入大約20 mL的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，再吸取1 mL的試驗(yàn)菌液(50～100 cfu/mL)到過(guò)濾器中，過(guò)濾。再用100 mL無(wú)菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次，取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同試驗(yàn)組。

　　③供試品對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，但不加試驗(yàn)菌液。

　　④稀釋劑對(duì)照組：方法與試驗(yàn)組同，其中供試液用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液代替。稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)÷菌液組的平均菌落數(shù)×100%

　　表1各試驗(yàn)菌株的回收率　略

　　從表1可知，在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率、試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%。可用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗方法檢查硝酸咪康唑搽劑的細(xì)菌、真菌及酵母菌數(shù)。

　　2.3.2控制菌檢查方法驗(yàn)證

　　①試驗(yàn)組：取供試液10 mL到薄膜過(guò)濾器中, 用無(wú)菌的0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL, 并在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗(yàn)菌(驗(yàn)證銅綠假單胞菌時(shí),試驗(yàn)菌為銅綠假單胞菌)，沖洗后取出濾膜放入預(yù)先制備好的相應(yīng)培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查。

　　②陰性菌對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，試驗(yàn)菌改為50～100 cfu陰性對(duì)照菌(2個(gè)控制菌驗(yàn)證的陰性對(duì)照菌均為大腸埃希菌)。

　　③菌液組 ：在過(guò)濾器中預(yù)先加入約20 mL的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，在吸取50～100 cfu試驗(yàn)菌到薄膜過(guò)濾器中，用100 mL 0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗1次。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于預(yù)先制備好營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置(36±1)℃培養(yǎng)48 h，記錄活菌數(shù)[5]。

　　3次平行試驗(yàn)結(jié)果一致，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

　　表2對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的驗(yàn)證結(jié)果　略

　　從表2可見(jiàn)，用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫pH7.080氯化鈉蛋白胨緩沖溶液作沖洗劑檢查銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌，方法成立。

　　3討 論

　　硝酸咪康唑搽劑為廣譜抗真菌藥，主要含有硝酸咪康唑、乙醇和二甲基亞砜等成分，對(duì)皮膚癬菌、念珠菌等有抗菌作用，對(duì)某些細(xì)菌也有一定抑制作用。《中國(guó)藥典》2005版規(guī)定，對(duì)藥品在微生物限度檢查時(shí)，其方法應(yīng)通過(guò)驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品的抑菌活性已被消除而保證檢查方法的可靠性。從本品的微生物限度檢查法的建立研究可見(jiàn)，選用薄膜過(guò)濾法聯(lián)用0.1%吐溫80pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液作沖洗劑來(lái)檢查本品的細(xì)菌數(shù)、真菌、酵母菌數(shù)及控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)的方法有效，在細(xì)菌總數(shù)、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)菌回收率均能達(dá)到70%以上;銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)組呈陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌對(duì)照組呈陰性反應(yīng)。本文結(jié)果可為同類產(chǎn)品的微生物限度檢查方法驗(yàn)證提供科學(xué)的依據(jù)。

　　【參考文獻(xiàn)】

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