用于代謝氣體分析的化學(xué)改性微流控肺泡芯片

　　要: 基于微機(jī)電系統(tǒng)( MEMS) 微納加工工藝和聚二甲基硅氧烷( PDMS) 軟刻蝕技術(shù)設(shè)計(jì)制作了一種包含細(xì)胞培養(yǎng)腔體與化學(xué)改性氣體富集區(qū)域的多層微流控肺泡芯片，來(lái)進(jìn)行片上三維細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞代謝的羰基氣體捕獲，并利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)捕獲羰基氣體進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 該芯片實(shí)現(xiàn)了肺癌細(xì)胞的片上培養(yǎng)，以及痕量代謝氣體捕獲。芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，樣品消耗小，為細(xì)胞氣體代謝分子體外分析提供了一種有效的手段。

　　本文源自魏昕鈺，李明虓 ，張靈倩 ，趙 陽(yáng) ，黃成軍 傳感器與微系統(tǒng) 2021 年 第 40 卷 第 6 期

　　關(guān)鍵詞: 肺癌細(xì)胞; 肺泡芯片; 化學(xué)改性; 代謝氣體分析

　　0 引 言

　　肺癌疾病的早期篩查對(duì)于此類疾病的治療具有重要意義[1]。生物學(xué)研究表明細(xì)胞的異常代謝氣體會(huì)溶于血液，通過(guò)呼吸作用排出體外。因此，對(duì)呼吸氣體的檢測(cè)結(jié)果可反映潛在病變細(xì)胞的新陳代謝水平，應(yīng)用于癌癥，尤其是肺癌的篩查和診斷[2]。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò) 196 種代謝氣體與肺癌疾病相關(guān)[3]，然而這種方法缺乏理論研究和數(shù)據(jù)支持，難以用于臨床治療。因此，在細(xì)胞級(jí)別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和數(shù)據(jù)支持是十分必要的。

　　微流控芯片具有集成度高，樣品消耗少等優(yōu)點(diǎn)[4]。微通道尺寸與體內(nèi)尺寸相當(dāng)，可進(jìn)行細(xì)胞三維培養(yǎng)和生物微環(huán)境模擬，構(gòu)建與細(xì)胞尺度匹配的三維空間，模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，真實(shí)地反映其生物學(xué)特征，為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面的研究提供一個(gè)新思路。

　　本文提出了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏的肺泡芯片。該芯片由聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微通道和聚 對(duì) 苯 二 甲 酸 乙 二醇 酯 ( polyethylene terephthalate， PET) 核孔膜組成，可實(shí)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的三維培養(yǎng)和醛類代謝氣體的捕獲，為呼吸檢測(cè)方法提供理論支持。

　　1 芯片制備

　　1. 1 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備

　　1. 1. 1 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

　　考慮到肺泡尺寸和肺部的氣血屏障結(jié)構(gòu)[5]，肺泡微流控芯片由兩層結(jié)構(gòu)化 PDMS( 30 mm × 15 mm × 2 mm) 和一層PET 核孔膜( 15 mm × 5 mm × 5 μm，孔徑 5 μm) 組成，分層示意圖如圖 1 所示。

　　1. 1. 2 芯片制備

　　PDMS 結(jié)構(gòu)采用軟光刻方法翻膜得到，模具為硅基結(jié)構(gòu)。首先設(shè)計(jì)微通道版圖，制作掩模版。之后，通過(guò)光刻、刻蝕等工藝進(jìn)行硅基圖形化。將 PDMS 預(yù)聚物和固化劑以 10︰1 的體積比充分混合，澆入硅基結(jié)構(gòu)，在 80 ℃ 下烘烤固化 3 h，之后脫模切割，用直徑 3 mm 的打孔器在兩端打孔，作為細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基等液體的出入口。PDMS 內(nèi)部微通道的深度為 100 μm，寬度為 500 μm，長(zhǎng)度為 15 mm，體積為 7. 5 μL( 制作工藝如圖 2( a) 所示) 。PET 核孔膜通過(guò)重離子打孔和化學(xué)擴(kuò)孔的工藝方法產(chǎn)生[6]，如圖 2( b) 所示，膜上有致密的小孔，每個(gè)小孔的形狀和尺寸基本相同，孔徑為 7 μm。

　　PDMS-PET 層間鍵和采用化學(xué)浸泡法[7]和表面氧等離子體處理相結(jié)合的方法，用到的化學(xué)試劑為 GLYMO 和 APTES 兩種硅烷偶聯(lián)劑。具體的處理方法為: 1) 首先，用去離子水分別配制 1 % 濃度的 GLYMO 溶液和 5 % 濃度的 APTES 溶液; 2) 將 PDMS 和 PET 分別放入 1 % 的 GLYMO 溶液中和 5 % 的 APTES 溶液中，各浸泡 20 min; 之后用去離子水沖洗后吹干; 3) 將 PDMS 和 PET 的鍵合面向上，放入等離子體腔室中，進(jìn)行氧等離子體表面處理，功率設(shè)置為中檔，注氧 90 s，取出后對(duì)準(zhǔn)鍵合到一起，完成芯片制作。得到最終的芯片實(shí)物如圖 2( c) 所示。

　　1. 2 表面改性

　　1. 2. 1 化學(xué)改性原理

　　為完成代謝氣體的片內(nèi)捕獲，這里使用氨氧基季銨鹽— 乙醇溶液完成 PDMS 化學(xué)改性，化學(xué)方程式為 H2NO - Z - N + /A - ，其中 Z 是連接基團(tuán)，可以取代芳基、烷基或者醚類基團(tuán)，A 可以是任意一種鹵族元素，如氯、溴、碘等。該分子一端的—ONH2基團(tuán)可以快速與細(xì)胞代謝產(chǎn)生的羰基化合物發(fā)生肟化反應(yīng)，得到醛肟或酮肟分子[8]，其可通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)方法識(shí)別。肟化反應(yīng)結(jié)構(gòu)式如圖 3 所示。

　　1. 2. 2 改性處理方法

　　使用氨氧基季銨鹽對(duì) PDMS 通道進(jìn)行化學(xué)改性處理，改性物質(zhì)化學(xué)名稱為 2—氨氧乙基季甲銨碘鹽 ( ATM) ，化學(xué)式如圖 3 所示。具體改性方法為: 1) 使用無(wú)水乙醇稀釋氨氧基鹽溶液，制備濃度為 4 mmol /L 的改性試劑; 2) 滴加 10 μL 改性試劑到 PDMS 微通道表面; 3) 待乙醇溶劑揮發(fā)后改性物質(zhì)存留在通道表面，完成 PDMS 的表面修飾。

　　2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

　　2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)

　　首先配制實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基溶液。由于 PDMS 通道狹長(zhǎng)，和傳統(tǒng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境相比更具挑戰(zhàn)性，因此增加培養(yǎng)基中 FBS( 胎牛血清) 的比例，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)狀態(tài)較好。具體培養(yǎng)基配制方法為 RPMI 1640︰FBS︰雙抗 = 100︰20︰1。

　　之后進(jìn)行微流控肺泡芯片的預(yù)處理，將鍵合好的芯片紫外照射 30 min 以上，之后用大量磷酸鹽緩沖液( PBS) 沖洗通道，排出溝道內(nèi)氣泡; 然后用去離子水配制 20 mg /mL 的人纖連蛋白溶液緩緩注入通道內(nèi)，放 入 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 箱 ( 37 ℃，5 % 濃度 CO2 ) 3 h 以上; 取出芯片后，使用培養(yǎng)基溶液沖洗通道，將混合均勻的，密度在 106 /mL 的肺癌細(xì)胞 ( A549) 懸液注入下層通道，培養(yǎng) 1 天左右，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁形態(tài)和增殖情況。

　　2. 2 代謝氣體檢測(cè)

　　2. 2. 1 質(zhì)譜檢測(cè)方法

　　質(zhì)譜( mass spectrometry，MS) 分析利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析這些粒子可獲得化合物的分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)等信息。實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)譜檢測(cè)儀器為 Orbitrap Fusion LUMOs，它具有可自動(dòng)進(jìn)樣、電場(chǎng)/磁場(chǎng)雙模式及檢測(cè)精度高的優(yōu)勢(shì)。

　　如圖 4 所示是一次實(shí)驗(yàn)測(cè)得的質(zhì)譜圖，設(shè)置 FTMS-pESI 模式( p 代表 positive，正離子模式) ，自動(dòng)進(jìn)樣 1 μL。圖中得到每個(gè)峰代表一種化合物，其中，質(zhì)荷比 m/z = 119. 12 代表原始的改性物質(zhì)( ATM) ，m/z = 131. 12 代表改性物質(zhì)捕獲到的甲醛氣體( CH2O) ，m/z = 145. 13 代表捕獲到的乙醛氣體( C2H4O) ，m/z = 159. 15 代表捕獲到的丙酮?dú)怏w ( C3H6O) ，m/z = 173. 17 代 表 捕 獲 到 的 2—丁 酮 氣 體 ( C4H8O) ，物質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)由氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用( GC-MS) 得到[9]。通過(guò)觀察混合溶液中每一種化合物的峰值強(qiáng)度，可以得知各種化合物在混合溶液中的相對(duì)含量，以及不同控制變量下各種物質(zhì)的變化。

　　2. 2. 2 實(shí)驗(yàn)組測(cè)試

　　每 12 h 為溝道內(nèi)的細(xì)胞更換培養(yǎng)基，確保細(xì)胞在溝道內(nèi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)胞代謝氣體經(jīng)過(guò)微孔膜與改性區(qū)域充分接觸。一天以后取下上層改性 PDMS，使用無(wú)水甲醇進(jìn)行洗脫富集，得到 50 μL 左右的反應(yīng)后溶液，將溶液進(jìn)行有機(jī)質(zhì)譜檢測(cè)，確定其反應(yīng)后成分。

　　2. 2. 3 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明

　　實(shí)驗(yàn)中使用的 PET 核孔膜購(gòu)自武威科近新發(fā)技術(shù)有限責(zé)任公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)溶液購(gòu)自 ThermoFisher，化學(xué)改性相關(guān)的試劑和溶液購(gòu)自 Sigma-Aldrich，基于肟化反應(yīng)的改性試劑由已公開(kāi)的方法[10]合成，PDMS 預(yù)聚物及其固化劑( SYLGARD 184) 購(gòu)自 TORAY( 日本) ，其他實(shí)驗(yàn)中用到的儀器包括倒置顯微鏡( CX41 OLYMPUS) ，細(xì)胞培養(yǎng)箱 ( Thermo SCIENTIFIC) ，生物安全柜( BIOBASE BSC—1100) ，等離子體清洗機(jī)( HARRICK PLASMA) ，水浴鍋( KEWEI) 。

　　3 結(jié)果與討論

　　3. 1 改性物質(zhì)在 PDMS 溝道內(nèi)的氣體捕獲效果

　　在微孔膜上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后，細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的羰基化合物可與改性物質(zhì)結(jié)合，起到代謝氣體捕獲的作用，氣體捕獲后的 PDMS 改性區(qū)域的顯微鏡圖片如圖 5 所示 。

　　3. 2 細(xì)胞在 PDMS 溝道內(nèi)的生長(zhǎng)特性

　　實(shí)驗(yàn)中使用熒光染料確定通道內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況: 將 10 μL Calcein-AM( 2 μmol /L ) 和 400 μL PI( 16 μg /mL ) 加入 4 590 μL PBS 溶液里混合均勻，配制成 Calcein-AM/PI ( Propidium Iodide) 細(xì)胞雙染試劑，在熒光顯微鏡下同時(shí)觀察 PDMS 通道里的活細(xì)胞和死細(xì)胞。Calcein-AM 可透過(guò)細(xì)胞膜，通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用脫去 AM 基 團(tuán)，產(chǎn) 生 的 Calcein( 鈣黃綠素) 發(fā)出強(qiáng)綠色熒光，因此活細(xì)胞在熒光顯微鏡下可被檢測(cè)到綠色熒光。另一方面 PI 通過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入到死細(xì)胞內(nèi)并嵌入細(xì)胞的 DNA 雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光，因此死細(xì)胞會(huì)被檢測(cè)到紅色熒光。

　　如圖 6 所示，細(xì)胞在通道內(nèi)正常貼壁，形態(tài)良好，可以持續(xù)保持細(xì)胞活性，染色后發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)量較多，死細(xì)胞數(shù)量很少，證明了微流控芯片可以較好地模擬細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞代謝水平。

　　3. 3 實(shí)驗(yàn)工藝和細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果的影響評(píng)估

　　在開(kāi)始肺泡芯片的實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行了對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，測(cè)試在化學(xué)改性時(shí)，PDMS 材料本身、表面氧等離子體處理、以及培養(yǎng)基對(duì)氣體檢測(cè)結(jié)果的影響。如圖 7 所示，對(duì)照組為改性試劑的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，PDMS 組為將改性試劑滴加在 PDMS 之后重新富集的質(zhì)譜結(jié)果，等離子體組為將 PDMS 注氧后滴加改性試劑再富集，而培養(yǎng)基組為將改性試劑混合少量培養(yǎng)基( ≈2 μL) 之后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

　　觀察質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)，這三組實(shí)驗(yàn)變量的結(jié)果與空白對(duì)照組類似，三種氣體成分的變化在實(shí)驗(yàn)誤差允許的范圍內(nèi)，證明 PDMS 材料本身，表面氧等離子體處理方法，以及培養(yǎng)基成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小，在實(shí)驗(yàn)中可以正常使用。

　　3. 4 細(xì)胞代謝氣體捕獲成分分析

　　統(tǒng)計(jì)每次實(shí)驗(yàn)組中捕獲的各羰基化合物成分的濃度含量，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，觀察 4 種羰基化合物成分的變化，做出它們的含量增值部分曲線，如圖 8 所示。圖中可觀察到 4 種氣體含量均有所增加，氣體量級(jí)在 0 ～ 80 μmol，其中丙酮?dú)怏w增加最顯著，甲醛和乙醛氣體也有明顯增多。而分析對(duì)照組的質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)其中并未存在 2—丁酮?dú)怏w，證明細(xì)胞代謝過(guò)程也會(huì)產(chǎn)生少許 2—丁酮。

　　相關(guān)生物學(xué)研究表明，肺癌會(huì)誘導(dǎo)氧化酶的生成并帶來(lái)“氧化應(yīng)激”，即機(jī)體活性氧成分與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)引起的一系列適應(yīng)性的反應(yīng)，這會(huì)引起特定揮發(fā)性代謝產(chǎn)物濃度的增高[11]。而羰基化合物氣體常在機(jī)體內(nèi)生化反應(yīng)過(guò)程中以中間產(chǎn)物形式生成，一些羰基化合物在給定的反應(yīng)中具有特異性，例如脂質(zhì)氧化會(huì)生成自由基。在本次實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)將微流控芯片與化學(xué)捕獲方法結(jié)合，本文進(jìn)行了四種羰基標(biāo)志物氣體在肺癌細(xì)胞代謝過(guò)程中的識(shí)別，結(jié)果表明肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程會(huì)生成較多的丙酮?dú)怏w、甲醛和乙醛氣體以及少量的 2—丁酮?dú)怏w。

　　4 結(jié) 論

　　介紹了一種用于細(xì)胞代謝氣體捕獲的微流控肺癌芯片，可進(jìn)行細(xì)胞的片上培養(yǎng)和醛類代謝氣體的識(shí)別。文中使用肺癌細(xì)胞( A549) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，芯片可以較好地完成細(xì)胞培養(yǎng)和氣體捕獲的功能，證明了芯片功能的有效性，為細(xì)胞代謝氣體的分析提供了一種有效的途徑，為呼吸檢測(cè)在肺癌疾病的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。