響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法優(yōu)化鷹嘴豆中抗炎活性成分的提取

　　摘要：以異黃酮提取率為評價指標(biāo)，考察超聲時間、乙醇濃度和料液比對鷹嘴豆異黃酮提取率的影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮提取工藝，得到最佳提取工藝條件為：提取時間為 1.73 h、乙醇濃度為 78.64%和料液比 1:24.9 g/mL，鷹嘴豆中異黃酮提取率為 0.76 mg/g。以 5-脂氧合酶為作用靶點，利用超濾-質(zhì)譜技術(shù)(UF-MS)篩選鷹嘴豆中具有抑制 5-脂氧合酶作用的潛在抗炎活性成分。結(jié)果表明，利用響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法可以進(jìn)一步優(yōu)化提高鷹嘴豆中活性成分的提取率;鷹嘴豆中具有潛在的抗炎活性成分為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素 A，其結(jié)合強度分別為 40.82%、36.93%、31.65%、28.75%和 22.51%。

　　關(guān)鍵詞：鷹嘴豆(Cicer arietinum L.);響應(yīng)面(RSM);遺傳算法(GA);超濾-質(zhì)譜(UF-MS); 5-脂氧合酶(5-LOX)

　　牛華周; 康賀磊; 侯萬超; 劉春明; 李賽男; 張語遲; 劉震 中國糧油學(xué)報 2021-12-31

　　鷹嘴豆(Cicer arietinum L.)又名雞豆和桃豆等，是豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子，在我國多個省份均有種植[1]，具有補中益氣、溫腎壯陽、主消渴之功效[2]。近年來，國內(nèi)外對鷹嘴豆的生物活性研究多有報道，鷹嘴豆中所含的異黃酮類成分具有抗氧化和抑制 Caco-2 細(xì)胞生長等作用[3]，但是對于鷹嘴豆中抗炎活性的研究報道很少。而 5-脂氧合酶對于炎癥的發(fā)生存在著密不可分的關(guān)系[4]，因此利用 5-脂氧合酶對鷹嘴豆中抗炎活性成分進(jìn)行初步研究，為從鷹嘴豆中分離抗炎活性成分提供一定的參考。鷹嘴豆異黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化是非線性的擬合過程，因此利用遺傳算法較為合適。遺傳算法是一種模擬自然進(jìn)化過程的全局尋優(yōu)算法[5]，在優(yōu)化天然產(chǎn)物有效成分的提取條件中有著廣泛應(yīng)用[6]。本實驗利用響應(yīng)面對鷹嘴豆異黃酮提取過程中的超聲時間、乙醇濃度和料液比 3 個因素進(jìn)行模擬推算，將響應(yīng)面優(yōu)化所得的擬合函數(shù)作為遺傳算法的適應(yīng)性函數(shù)，在程序中進(jìn)行個體評價、選擇運算、交叉運算以及變異運算。運行遺傳算法優(yōu)化利用 Matlab 2018b 程序和程序附帶的 GAOT 工具箱完成[7]。實驗以鷹嘴豆為研究對象，首先從單因素水平考察了提取條件對提取率的影響;其次，應(yīng)用響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的提取方法;利用超濾-質(zhì)譜技術(shù)對鷹嘴豆粗提中的化學(xué)成分進(jìn)行抗炎活性成分篩選。應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對鷹嘴豆中抗炎活性成分進(jìn)行初步鑒定。

　　1 材料與儀器

　　1.1 材料與儀器

　　鷹嘴豆，豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子。5-脂氧合酶;乙腈(色譜級);超濾離心管(100 ku)。 Waters 2695 高效液相色譜儀，LCQ-Fleet 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，DK-98-Ⅱ 恒溫水浴鍋，KQ-400DE 型超聲波清洗器。

　　1.2 方法 1.2.1 超聲輔助提取工藝的優(yōu)化 1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　取 5.12 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用 65%乙醇溶液溶解、定容于 25.0 mL 容量瓶中備用。分別取 1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0 和 6.0 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照文獻(xiàn)[8]方法分別加入顯色劑，顯色 10 min，采用紫外-可見分光光度計在 510 nm 測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，制作鷹嘴豆異黃酮濃度吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　1.2.1.2 鷹嘴豆的提取

　　鷹嘴豆粉碎后過 100 目篩，按料液比加入乙醇溶液，超聲提取，過濾后蒸干，用 65% 乙醇溶解，顯色，測定鷹嘴豆異黃酮含量。

　　1.2.1.3 單因素實驗

　　準(zhǔn)確稱取粉碎后的鷹嘴豆 5.0 g，采用超聲法提取鷹嘴豆異黃酮，分別考察了超聲時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇濃度(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、 85.0%、95.0%)和料液比(1：10.0、1：15.0、1：20.0、1：25.0、1：30.0、1：35.0、1： 40.0 g/mL)對鷹嘴豆異黃酮提取率的影響。

　　1.2.1.4 響應(yīng)面實驗

　　依據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取超聲時間(X1)、乙醇濃度(X2)和料液比(X3)為實驗因素，以異黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，利用 Design-Expert 中的 Box-Behnken 組合，進(jìn)行 3 因素 3 水平的響應(yīng)面實驗，實驗因素與水平設(shè)計如表 1 所示。 式中：Xi 和 Xj為自變量，b0、bi、bii 和 bij分別為截距、線性回歸、二次項的回歸、各交互項的回歸的系數(shù)[9]。

　　1.2.1.5 遺傳算法設(shè)計優(yōu)化

　　在 MATLAB 程序中，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱對數(shù)據(jù)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模。實驗創(chuàng)建的提取因素優(yōu)化模型為 3 層 ANN 模型(輸入層、隱含層和輸出層)，輸入層作為自變量;輸出層給出因變量[10]。選擇超聲時間、乙醇濃度和料液比為自變量，鷹嘴豆異黃酮提取率為因變量，選擇輸入層三個神經(jīng)元，輸出層一個神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)模型。經(jīng)過多次訓(xùn)練實驗，得到了最佳的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。采用優(yōu)化得到的擬合函數(shù)，利用遺傳算法對輸入變量(超聲時間、乙醇濃度和料液比)進(jìn)行優(yōu)化，以使鷹嘴豆異黃酮提取率最大為目標(biāo)。設(shè)置遺傳算法的搜索范圍大小為-1～1，優(yōu)化得出全局優(yōu)化解[11]。

　　1.2.2 超濾-質(zhì)譜法篩選鷹嘴豆提取物中 5-脂氧合酶抑制劑

　　200.0 μL 的反應(yīng)體系分別由 100.0 μL Tris-HCl 緩沖溶液、20.0 μL 300 mg/mL 樣品溶液與 80.0 μL 不同濃度的 5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0 和 10 U/mL，pH 7.2~7.4)組成，將反應(yīng)體系渦旋震蕩，混勻后 37℃水浴孵育 30 min，利用超濾膜(100 ku)分離與酶結(jié)合的復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，分離時采用離心機在 13000 r/min 的條件下離心 10 min。加入 100.0 μL Tris-HCl 緩沖溶液沖洗超濾膜，沖洗未結(jié)合的小分子化合物，離心 10 min，重復(fù)該操作 3 次。再加入 100.0 μL 50%甲醇水(50：50)溶液，釋放與 5-脂氧合酶結(jié)合的活性小分子，離心 10 min，重復(fù)步驟 3 次。將甲醇洗脫液合并，分析測定各活性成分的含量。空白對照組由緩沖溶液代替酶溶液，其他條件不變，重復(fù)實驗 3 次。活性成分與酶的結(jié)合能力以增強因子表示，計算公式為：

　　式中：A1 為與 5-脂氧合酶結(jié)合的活性小分子化合物的量，A2 為未與 5-脂氧合酶結(jié)合的小分子化合物初始的量[12]。

　　1.2.3 高效液相色譜以及質(zhì)譜檢測條件

　　色譜柱為 SunFireTM C18 色譜柱(4.6 mm × 250 mm，I.D.5.0 μm，Waters)，檢測器：Waters 2998 二極管陣列檢測器，流動相：水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度：0~10 min，3%~3% B; 10~40 min，3%~65% B;40~60 min，65%~100% B，檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量：10.0 μL。利用六通閥聯(lián)接質(zhì)譜與液相色譜二極管陣列檢測器(DAD)，選擇大氣壓化學(xué)電離離子源(APCI)為質(zhì)譜離子源，掃描范圍為 150~400 0;采用正離子分析模式;離子阱壓力為 3.10 × 107 Pa;鞘氣輔助氣為高純度 N2。液相色譜參數(shù)同上述高效液相色譜參數(shù)。

　　1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

　　每組實驗重復(fù) 3 次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;采用 Design-Expert 軟件中 Box- Behnken 組合對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA);采用 Matlab 軟件優(yōu)化超聲提取鷹嘴豆中異黃酮工藝參數(shù);Design-Expert8.0.6 軟件設(shè)計組合實驗以及繪制響應(yīng)面圖形，利用 Origin 進(jìn)行單因素試驗繪圖。

　　2 結(jié)果分析

　　2.1 單因素試驗結(jié)果

　　超聲提取鷹嘴豆異黃酮的單因素實驗，結(jié)果如圖 2 所示。超聲時間在 0~1.5 h 內(nèi)鷹嘴豆異黃酮提取率逐漸增加，超時時間大于 1.5 h 后提取率逐漸降低。提取時間為 1.5 h 時，鷹嘴豆異黃酮提取率達(dá)到最大值。由于超聲破壞了鷹嘴豆的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致鷹嘴豆細(xì)胞內(nèi)異黃酮大量溶出，因此超聲時間越長，異黃酮的溶出率越高，隨提取時間的繼續(xù)增加，鷹嘴豆細(xì)胞組織中大量細(xì)胞破裂，其他雜質(zhì)的溶出，影響鷹嘴豆異黃酮的溶出率[13]，因此最佳超聲時間為1.5h。

　　鷹嘴豆異黃酮的提取率在乙醇濃度為 30%~70%時，隨著乙醇濃度的增加逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度大于 80%時，提取率逐漸降低。該現(xiàn)象可能由于乙醇濃度增加，異黃酮的溶解度逐漸降低引起的。異黃酮一般易溶于高濃度有機溶劑，但異黃酮苷一般易溶于低濃度乙醇等有機溶劑。異黃酮苷在超聲提取條件下不易分解，因此在乙醇濃度為 35%~75%時，提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加時，將不利于鷹嘴豆中大量的異黃酮苷的溶出，因此提取率會降低[14]，因此最佳乙醇濃度的為 75%。

　　鷹嘴豆異黃酮提取率在料液比 1：10.0 至 1：25.0g/mL 之間呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，是因為隨著料液比的增加，鷹嘴豆和溶劑之間的濃度差增加，加速異黃酮的溶出。當(dāng)料液比大于 1：25.0 時，乙醇體積過多時也可能造成其他物質(zhì)的滲出，影響異黃酮的溶出[15]。因此最佳料液比為 1：25.0 g/mL。

　　2.2 響應(yīng)面分析實驗結(jié)果

　　鷹嘴豆異黃酮的提取條件選取超聲時間、乙醇濃度和料液比三個因素，根據(jù) Box-Behnken 實驗原理，利用 Design-Expert 程序，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面實驗，見圖 3。利用響應(yīng)面優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件，并擬合出相應(yīng)的函數(shù)，結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。利用響應(yīng)面擬合得到的函數(shù)為： 2 2 2 Y A B C AB BC A B C ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.74 0.04 0.05 0.02 0.04 0.03 0.06 0.10 0.14 (3)所選用的二次多項模型 P < 0.05，R 2=0.92，說明該模型二次方程顯著，本方法可靠，對模擬分析三因素三水平實驗條件是可行的。并且 f>0.05 為模型項顯著。

　　2.3 遺傳算法優(yōu)化實驗結(jié)果

　　利用 Matlab R2018b 軟件中的遺傳算法優(yōu)化工具箱，在響應(yīng)面所構(gòu)建的擬合函數(shù)的基礎(chǔ)上，以鷹嘴豆異黃酮提取率為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)。經(jīng)過 N 迭代后，適應(yīng)度函數(shù)值趨向適應(yīng)度最高的個體[16]，即鷹嘴豆異黃酮提取率的最大值。由圖 4 可見，當(dāng)?shù)?13 次時，群體的適應(yīng)性函數(shù)變化趨勢達(dá)到最大值 0.76，即鷹嘴豆異黃酮提取率最大值為 0.76 mg/g，此時超聲時間(X1)、乙醇濃度(X2)、和料液比(X3)水平編碼分別為 0.47、0.36 和-0.02，即實驗水平分別為 1.73 h、78.64%和 1:24.9 g/mL。在此條件下，提取鷹嘴豆中異黃酮的成分，所得異黃酮含量理論值為 0.76 mg/g，遺傳算法優(yōu)化結(jié)果如圖 4 所示。響應(yīng)面與遺傳算法相結(jié)合對鷹嘴豆最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，能較準(zhǔn)確地優(yōu)化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件。

　　2.4 超濾-質(zhì)譜技術(shù)篩選鷹嘴豆 5-脂氧合酶抑制劑

　　鷹嘴豆超濾實驗的空白對照組以及分別與 80.0 μL 不同濃度的 5-脂氧合酶(0.5、1.0 和 10.0 U/mL)結(jié)合的實驗組 HPLC 圖見圖 5。鷹嘴豆提取物中有 5 個成分可以與 0.5、1.0 和 10.0 U/mL 的 5-脂氧合酶結(jié)合，對 5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潛在的抗炎活性[17]。各活性成分與酶的結(jié)合強度用結(jié)合因子為，考察 5 個化合物與 5-脂氧合酶的結(jié)合能力。由表 2 可知：5 個活性成分對濃度為 1.0 U/mL 的 5-脂氧合酶活性抑制效果顯著，其中化合物 5 的結(jié)合強度最高，其次為化合物 2、化合物 3、化合物 4 和化合物 1。通過超濾-質(zhì)譜技術(shù)研究鷹嘴豆與 5-脂氧合酶的抑制作用，操作簡便，超濾-質(zhì)譜技術(shù)具有高通量檢測的優(yōu)勢，是一種快速高效的初步篩選復(fù)雜提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作簡單等優(yōu)勢。

　　2.5 液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)初步鑒定鷹嘴豆中化學(xué)成分

　　利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對鷹嘴豆提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行初步的分離與鑒定，通過質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品比對，分析鷹嘴豆中的化學(xué)成分的信息，結(jié)果如表 3。利用液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對鷹嘴豆提取物中活性成分進(jìn)行初步鑒定和解析，根據(jù)各化合物的保留時間、分子離子以及碎片離子等信息，鑒定 5 個具有抑制 5-脂氧合酶活性的異黃酮類化合物分別為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素 A [19-22]。

　　3 結(jié)論

　　利用遺傳算法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化鷹嘴豆中異黃酮的提取工藝，優(yōu)化得到最佳提取工藝為：提取時間為 1.73 h、乙醇濃度為 78.64%和料液比 1:24.90 g/mL，在此條件下，鷹嘴豆中異黃酮提取率為 0.76 mg/g。利用超濾質(zhì)譜法篩選出鷹嘴豆中 5 個具有抑制 5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度為 1.0 U/mL 時，抑制酶的活性效果顯著，鷹嘴豆芽素 A 與 5-脂氧合酶結(jié)合度最高，為天然抗炎藥物的開發(fā)與利用提供了參考。