牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關(guān)性分析

　　摘 要 目的：研究牡丹皮炒炭前后顏色與有效成分含量的相關(guān)性，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質(zhì)量評價提供參考。方法：使用色差儀測定牡丹皮炒炭前后飲片粉末顏色的色度空間參數(shù)[明度值(L*)、紅綠分量值(a*)、黃藍分量值(b*)及總色差值(E*ab)]，采用高效液相色譜法測定牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末中10種有效成分(沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素)的含量，并應(yīng)用SPSS 21.0軟件對顏色的色度空間參數(shù)和有效成分含量進行相關(guān)性分析。

　　結(jié)果：沒食子酸含量與色度空間參數(shù)均無相關(guān)性(P>0.05);5-羥甲基糠醛含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性負相關(guān)(P<0.01)，與a*呈極顯著性正相關(guān)(P<0.01);芍藥苷含量與L*、b*、E*ab呈極顯著性正相關(guān)(P<0.01)，與a*無相關(guān)性(P>0.05);氧化芍藥苷含量與L*、E*ab呈極顯著性正相關(guān)(P<0.01)，與a*呈極顯著性負相關(guān)(P<0.01)，與b*無相關(guān)性(P>0.05);兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素含量與L*、b*、E*ab均呈顯著性正相關(guān)(P<0.05)，與a*呈顯著性負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：色差技術(shù)可以量化牡丹皮和牡丹皮炭飲片的顏色，牡丹皮炒炭前后顏色與其有效成分含量具有顯著的相關(guān)性。

　　關(guān)鍵詞 牡丹皮;牡丹皮炭;含量;顏色;相關(guān)性分析

　　《農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究》是在較高層面上反映中國農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究與技術(shù)成果的學(xué)術(shù)性刊物，由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院主辦，安徽吳楚科技文化傳播公司提供技術(shù)支撐。

　　牡丹皮為毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的干燥根皮，味苦、辛，微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于熱入營血、溫毒發(fā)斑、吐血衄血、夜熱早涼、無汗骨蒸、經(jīng)閉痛經(jīng)、跌撲傷痛、癰腫瘡毒等癥[1]。牡丹皮炭為牡丹皮的炒炭品，具有涼血止血的作用，用于吐血、崩漏及多種血熱出血證[2]。研究發(fā)現(xiàn)，牡丹皮及牡丹皮炭飲片中均含有酚及酚苷類成分(如丹皮酚)、單萜及其苷類成分(如芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷)和其他成分[如5-羥甲基糠醛(5-HMF)、沒食子酸、兒茶素、槲皮素、山柰素、異鼠李素]等多種有效成分[3-6]，且這些有效成分具有解熱、活血化瘀、收斂止血、抑制血小板聚集等功效[7-10]，與牡丹皮及牡丹皮炭飲片的功效一致。

　　2015年版《中國藥典》(一部)[1]中關(guān)于牡丹皮炮制前后的質(zhì)量控制，主要是通過傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別外觀性狀、顏色和丹皮酚含量測定相結(jié)合的方法。但顏色評價具有很大的主觀性和模糊性，而飲片顏色差異常常反映其質(zhì)量優(yōu)劣，且與飲片內(nèi)在物質(zhì)成分含量的高低也息息相關(guān)[11-12]。目前，牡丹皮和牡丹皮炭飲片成分和顏色之間的相關(guān)性尚未見報道，故有必要對牡丹皮炒炭前后顏色進行客觀、數(shù)字化評價，并對顏色和成分之間的相關(guān)性進行分析。

　　色彩色差計又稱為光電反射光度計，其可以用光電測定的方法，迅速、準(zhǔn)確、方便地測出各種試樣被測位置的顏色，并且通過計算機直接換算成明度值(L*)、紅綠分量值(a*)、黃藍分量值(b*)對顏色進行數(shù)值化表示[13]。近年來，色差分析在食品、藥品方面應(yīng)用較多，如萬超等[14]采用色差計測定醋延胡索飲片顏色并與主要成分含量進行相關(guān)性分析，實現(xiàn)了醋延胡索質(zhì)量的快捷評價;徐珍珍等[12]利用色差計對木香粉末的色差值進行測定并與有效成分木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯和揮發(fā)油的含量相關(guān)聯(lián)，為木香質(zhì)量評價體系的建立提供了參考。

　　因此，本研究采用色差計對牡丹皮和牡丹皮炭飲片粉末進行顏色的測定，將傳統(tǒng)的顏色指標(biāo)進行客觀化和數(shù)字化，并與其有效成分(沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素)含量進行相關(guān)性研究，為牡丹皮和牡丹皮炭飲片的鑒別和質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 材料

　　1.1 儀器

　　CR-400/410色彩色差計、CR-A50粉末測試盒、CR-A33e玻璃防光保護盒(日本柯尼卡美能達有限公司);1100系列高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)，配備一個光電二極管陣列檢測器(美國安捷倫公司);CY-20炒藥機(江陰市祝塘明科機械廠);JP-105A高速多功能粉碎機(永康市久品工貿(mào)有限公司)。

　　1.2 藥品與試劑

　　10批牡丹皮藥材分別購買于10個不同地區(qū)，由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定均為毛茛科植物牡丹P. suffruticosa Andr.的干燥根皮，藥材收集后裝入密封袋存放于干燥器中陰涼避光處保存，并于3年內(nèi)完成試驗;兒茶素對照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-12050702，純度：≥98%);山柰素對照品(批號：110861-201310，純度：≥98%)、異鼠李素對照品(批號：110860-201410，純度：≥98%)均購自中國食品藥品檢定研究院;5-HMF對照品(批號：150802，純度：≥98%)、沒食子酸對照品(批號：140801，純度：≥98%)、氧化芍藥苷對照品(批號：150822，純度：≥98%)、芍藥苷對照品(批號：150609，純度：≥98%)、槲皮素對照品(批號：140425，純度：≥98%)和苯甲酰芍藥苷對照品(批號：150903，純度：≥98%)均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;丹皮酚對照品(本實驗室自制，批號：20150708，純度：≥98%);乙腈和甲酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。牡丹皮藥材來源見表1。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 牡丹皮和牡丹皮炭樣品的制備

　　2.1.1 牡丹皮飲片樣品的制備 取牡丹皮藥材，迅速洗凈，潤后切薄片，曬干，粉碎過5號篩，即得。

　　2.1.2 牡丹皮炭飲片樣品的制備 分別取一半的各批次牡丹皮樣品，照2015年版《中國藥典》(四部)通則0213中炒炭法[15]，并結(jié)合課題組前期優(yōu)選的炮制工藝[16]炒至樣品表面呈黑褐色，內(nèi)部黃褐色。取出，晾涼，粉碎過5號篩，即得(對應(yīng)飲片樣品編號為PMC-01～PMC-10)。

　　2.2 牡丹皮炒炭前后顏色的色度空間參數(shù)測定

　　采用色彩色差計分別對牡丹皮樣品和牡丹皮炭粉末進行客觀評價。每批樣品測定5次，取平均數(shù)。測定條件為光源D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度2°，照明口徑50 mm，儀器誤差(ΔE*ab)在0.8以內(nèi)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差(ΔE*ab)在0.07以內(nèi)，以色度空間參數(shù)L*、a*、b*進行色澤量化，總色差值(E*ab)=[(L*)2+(a*)2+(b*)2]1/2。

　　2.2.1 精密度考察 取樣品RMC-01適量，在同一時間點測量顏色的色度空間參數(shù)，重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為0.07%、0.67%和0.14%(n=5)，表明儀器精密良好。

　　2.2.2 在不同界光亮強度下的穩(wěn)定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內(nèi)，分別在同一天的不同時間點(8 ∶ 30、11 ∶ 30、14 ∶ 30、17 ∶ 30、20 ∶ 30)測量顏色的色度空間參數(shù)，每個時間點重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為0.92%、2.73%和2.01%(n=5)，表明外界光強度對試驗結(jié)果影響較小。

　　2.2.3 樣品穩(wěn)定性考察 取樣品RMC-01適量，置于同一裝載容器內(nèi)，分別放置0、1、2、3、4、5 d后測量顏色的色度空間參數(shù)，每次重復(fù)測量5次，取平均值。結(jié)果，L*、a*、b*的RSD分別為1.14%、2.76%和2.21%(n=5)，表明樣品5 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

　　2.2.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片顏色的色度空間參數(shù)測定 分別取10批牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按 “2.2”項下方法操作，測定各樣品顏色的色度空間參數(shù)，結(jié)果見表2。

　　2.2.5 牡丹皮和牡丹皮炭顏色差異性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，采用SPSS 21.0軟件進行相關(guān)分析。由于測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數(shù)數(shù)據(jù)不完全符合多元正態(tài)性和方差齊性分布，故選擇KruskaWallis H秩和檢驗進行分析。以牡丹皮和牡丹皮炭分類作為分組變量，牡丹皮和牡丹皮炭的L*、a*、b*為檢驗變量，經(jīng)KruskaWallis H檢驗發(fā)現(xiàn)，牡丹皮和牡丹皮炭L*、a*、b*的χ2值分別為14.286、9.143、13.166(P均<0.01)，拒絕H0，接受H1，可認為二者間顏色有顯著性差異。

　　2.2.6 牡丹皮和牡丹皮炭顏色判別分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為分組變量，測得的牡丹皮和牡丹皮炭顏色的色度空間參數(shù)為自變量，并且作為訓(xùn)練集樣本。采用SPSS 21.0軟件建立以L*、a*、b*為輸入的判別兩組的判別函數(shù)。再用訓(xùn)練集樣本回代[17-18]，對判別函數(shù)進行驗證。由組間均值相等性檢驗結(jié)果可知，自變量L*、a*、b*的P均<0.01，表明在判別函數(shù)中L*、a*、b*均有統(tǒng)計學(xué)意義，L*、a*、b*的λ值(反映組間差異程度，λ值越接近0，組間差異越顯著)分別為0.092、0.603、0.364，其中L*的λ值最接近0，故可認為L*判別更有意義。由Wilk’s Lambda檢驗結(jié)果建立了典型判別函數(shù)，λ值為0.045，P=0，判別函數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義，標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)=2.794×L*+2.839×a*-1.421×b*，非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)=0.987×L*+3.816×a*-1.575×b*-49.308。將樣本數(shù)據(jù)代入非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別函數(shù)，得到各樣本的函數(shù)值，函數(shù)值大于0的樣本，判到“牡丹皮”，反之判到“牡丹皮炭”。Fisher的線性判別式函數(shù)分別為牡丹皮=71.904×L*+334.979×a*-159.175×b*-1 895.500，牡丹皮炭=63.282×L*+301.656×a*-145.960×b*-1 464.970，將樣本數(shù)據(jù)代入兩個線性判別式函數(shù)中，得出兩個函數(shù)值，將樣本判入所得函數(shù)值較大的分組中。

　　2.3 多成分含量測定

　　2.3.1 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱量樣品粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，室溫超聲(功率：300 W，頻率：50 kHz)提取30 min，然后以20 000 r/min離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加50%甲醇定容并搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

　　2.3.2 色譜條件 參考本課題組前期測定牡丹皮炮制前后化學(xué)成分(沒食子酸、5-HMF、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚、山柰素)含量的條件和方法[9]，色譜條件如下：色譜柱為Ultimate TM XB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)(V/V)，梯度洗脫(0～30 min，5%→15%A;30～60 min，15%→50%A;60～70 min，50%→95%A);檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL/min;進樣量為10 μL。

　　2.3.3 方法學(xué)考察 按照相關(guān)方法進行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，10個成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)R2均>0.999 1;檢測限和定量限范圍分別為2.4～37.5 ng和0.011～0.258 2 μg;在精密度試驗中，日內(nèi)、日間的RSD分別為0.16%～1.97%、0.39%～2.06%(n=6);在穩(wěn)定性試驗中，峰面積的RSD均<3.0%(n=6);平均回收率為91.8%～109.5%，RSD均<5.0%(n=6)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可行。

　　2.3.4 牡丹皮及牡丹皮炭飲片中10個有效成分含量的測定 取牡丹皮和牡丹皮炭飲片，按“2.3.1” 項下方法制成樣品溶液，按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，并計算各成分的含量，每個樣品重復(fù)測定3次，結(jié)果見表3。

　　2.4 相關(guān)性分析

　　2.4.1 顏色與牡丹皮炒炭前后的Pearson相關(guān)性分析 將樣本分為牡丹皮組和牡丹皮炭兩組，以組別為自變量，L*、a*、b*、E*ab為因變量，利用SPSS 21.0軟件對其進行Pearson相關(guān)性檢驗。結(jié)果，組別與L*、a*、b*、E*ab的相關(guān)性系數(shù)分別為-0.953、0.630、-0.797、-0.955，雙側(cè)P均<0.05，可認為牡丹皮炒炭前后與L*、b*、E*ab呈顯著性負相關(guān)，而與a*則呈顯著性正相關(guān)。

　　2.4.2 顏色與有效成分含量的Pearson相關(guān)性分析 利用SPSS 21.0軟件對牡丹皮和牡丹皮炭飲片中10個有效成分的含量與其色度空間參數(shù)L*、a*、b*、E*ab進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。

　　從表4可以看出，牡丹皮和牡丹皮炭飲片中除了沒食子酸外，其他成分含量均與顏色的色度空間參數(shù)有顯著相關(guān)性。其中，兒茶素、槲皮素、苯甲酰芍藥苷、異鼠李素、丹皮酚和山柰素含量與L*、b*、E*ab存在顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*存在顯著性負相關(guān)關(guān)系;5-HMF含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性負相關(guān)關(guān)系，與a*存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系;芍藥苷含量與L*、b*、E*ab存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*無相關(guān)性;氧化芍藥苷含量與L*、E*ab存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系，與a*存在極顯著性負相關(guān)關(guān)系，與b*無相關(guān)性。