表達(dá)透明顫菌血紅蛋白對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響

　　摘要：產(chǎn)油酵母的油脂合成是高度耗氧的生物過程，為提高油脂合成過程中細(xì)胞利用氧氣的能力，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合到油脂高產(chǎn)菌株圓紅冬孢酵母的染色體中。首先構(gòu)建了透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達(dá)載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化至R.toruloidesNP11中，獲得重組菌株。Westernblot和CO差異光譜分析表明，透明顫菌血紅蛋白在R.toruloidesNP11中成功表達(dá)并且具有生物活性。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明：與出發(fā)菌株相比，在氧氣充足條件下，重組菌株NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%;在氧氣不足條件下，重組菌株NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%;在限氧和不限氧的條件下，透明顫菌血紅蛋白均能夠促進(jìn)圓紅冬孢酵母的油脂積累。

　　本文源自可再生能源,2020,38(09):1143-1148.’《可再生能源》雜志，于1983年經(jīng)國家新聞出版總署批準(zhǔn)正式創(chuàng)刊，CN:21-1469/TK，本刊在國內(nèi)外有廣泛的覆蓋面，題材新穎，信息量大、時效性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中主要欄目有：政策與管理 、研究與實(shí)驗(yàn) 、實(shí)用技術(shù)等。

　　化石燃料的日益耗竭和環(huán)境問題的日益凸顯，使得人們將目光投向綠色可再生能源。作為生物柴油的原料之一，微生物油脂具有生產(chǎn)周期短、底物來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，因而受到研究者的廣泛關(guān)注。自然界中，少數(shù)微生物可在細(xì)胞內(nèi)合成并儲存超過自身細(xì)胞干重20%以上的油脂，這些微生物被稱為“產(chǎn)油微生物”[1]。圓紅冬孢酵母屬于紅酵母屬，其油脂積累可達(dá)細(xì)胞干重的60%以上，同時，其可以利用的底物較為廣泛，木糖、甘油、木質(zhì)纖維素等廉價的原料均可被其用于油脂發(fā)酵[2,3,4]。

　　透明顫菌是一種專性好氧原核生物，其胞內(nèi)表達(dá)的血紅蛋白(VHb)使其在貧氧的環(huán)境下依然能夠生存。透明顫菌血紅蛋白與氧氣的結(jié)合速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其與氧氣的解離速率，因此，透明顫菌能夠在胞內(nèi)儲存更多的氧氣[5]。胞內(nèi)儲存的氧氣可以加速胞內(nèi)氧化磷酸化的效率;影響細(xì)菌胞內(nèi)的Fnr,OxyR轉(zhuǎn)錄因子，從而提高胞內(nèi)透明質(zhì)酸、β-葡萄糖苷酶等異源蛋白的表達(dá)量;參與胞內(nèi)的代謝途徑，增加胞內(nèi)代謝物的產(chǎn)量[6,7,8,9,10]。

　　微生物油脂發(fā)酵后期，細(xì)胞密度增大，導(dǎo)致溶氧量不足，使得細(xì)胞生長受到抑制，胞內(nèi)產(chǎn)物不能正常積累。提高溶氧的傳統(tǒng)方法有增加攪拌速率和增大通氣量，但是，這兩種方法均會增加機(jī)械力從而對細(xì)胞具有一定損傷。因此，通過基因工程技術(shù)來緩解氧氣供給不足的情況是一種行之有效的替代方法。XueSJ研究了透明顫菌血紅蛋白對菌中普魯蘭產(chǎn)量的影響，研究結(jié)果表明，普魯蘭的產(chǎn)量從72.0g/L增加至102.3g/L[11]。ZhangH的研究表明，在溶氧量為30%的3L發(fā)酵罐中，與出發(fā)菌株相比，表達(dá)vgb基因的重組菌株Yarrowialipolytica的生物量增加了27%，油脂含量增加了38.69%[12]。

　　本文嘗試通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，將透明顫菌的血紅蛋白基因vgb整合至圓紅冬孢酵母中，并考察重組菌株在氧氣溶量不同的發(fā)酵條件下的細(xì)胞生長和油脂積累情況，為微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

　　1、材料和方法

　　1.1菌株和質(zhì)粒

　　本實(shí)驗(yàn)所用的菌株和質(zhì)粒的信息如表1所示。

　　表1所用菌株和質(zhì)粒

　　1.2工具酶和試劑

　　PrimeSTARDNA聚合酶、rTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DpnI等均購自大連TaKaRa公司;DNAMarker2KplusII購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和其他生物試劑均購于上海生工生物工程股份有限公司，測序工作委托蘇州泓汛公司完成;其他試劑均為分析純試劑。本研究所用的引物如表2所示。

　　表2本研究所用的引物

　　1.3培養(yǎng)基

　　LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L和氯化鈉10.0g/L,pH值為7.0。

　　LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂粉15.0g/L。

　　YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/L、酵母提取物10.0g/L和蛋白胨20.0g/L,pH值為6.0。

　　YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂粉15.0g/L。

　　氮源限制培養(yǎng)基(NL培養(yǎng)基)：葡萄糖70g/L、硫酸銨0.1g/L、酵母提取物0.75g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、結(jié)晶硫酸鎂1.5g/L、體積分?jǐn)?shù)為1%的痕量元素儲液(結(jié)晶氯化鈣4.0g/L、結(jié)晶硫酸亞鐵0.55g/L、一水合檸檬酸0.52g/L、結(jié)晶硫酸鋅0.1g/L、結(jié)晶硫酸錳0.076g/L和100μL18M的濃硫酸)，pH值為6.0。

　　MM鹽溶液：磷酸氫二鉀2.05g/L、磷酸二氫鉀1.45g/L、氯化鈉0.15g/L、硫酸鎂0.5g/L、氯化鈣0.066g/L、七水硫酸鐵0.00248g/L和硫酸銨0.5g/L,pH值為7.0。

　　IM誘導(dǎo)平板：MM鹽溶液400mL、甘油5mL、去離子水540mL、瓊脂粉20g，高壓滅菌后加入40mL1M的MES和最終濃度為200μM的乙酰丁香酮(以上為配置1L時的添加量)。培養(yǎng)微生物的過程中，可根據(jù)需求添加適量的抗生素。

　　1.4載體構(gòu)建

　　設(shè)計含有NcoI和SpeI兩個酶切位點(diǎn)的引物NcoI-F和Ble-P2A-VHb-R，擴(kuò)增pUC57-vgb得到NcoI-vgb-SpeI片段;將質(zhì)粒pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-mcs-THSP與該片段同時進(jìn)行NcoI和SpeI雙位點(diǎn)酶切，再連接;通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，在含有50μg/mL的Kan的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子并測序，獲得重組載體pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP。

　　1.5重組菌株的構(gòu)建

　　將測序正確的pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgbTHSP載體電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞中，并在含有50μg/mL的Kan的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取基因型正確的重組農(nóng)桿菌單克隆轉(zhuǎn)接于5mLLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL的Kan)中。同時，挑取圓紅冬孢酵母NP11接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中，兩種菌株均在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)16h。取一定量的菌液于1.5mL離心管中，于13000r/min離心30s，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌1次。用無菌蒸餾水將菌稀釋至OD600=0.6，分別吸取100μL稀釋好的農(nóng)桿菌和酵母菌等量混合，涂布于IM平板濾紙載面上，并放于24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d，將濾紙轉(zhuǎn)至潮霉素抗性濃度為50μg/mL的YPD平板進(jìn)行重組菌株的篩選，長出轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證及基因型驗(yàn)證。

　　1.6VHb表達(dá)及功能驗(yàn)證

　　分別在平板上挑取出發(fā)菌株R.toruloidesNP11(簡記為NP11)與重組菌R.toruloidesNG-20,R.toruloidesNG-21和R.toruloidesNG-22(分別簡記為NG-20,NG-21和NG-22)單菌落轉(zhuǎn)接于50mLYPD液體培養(yǎng)基，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h后，以1∶50的比例轉(zhuǎn)接于50mLYPD培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h后，離心收集菌體，超純水洗2次，緩沖液(100mM的磷酸鉀溶液，pH值為7.4)洗滌1次，將其重懸于10mL上述緩沖液中至菌體冷卻;將Mini型低溫高壓破碎儀(廣州聚能納米生物科技股份有限公司)的壓力調(diào)至180MPa，然后將重懸菌體破碎3次，再于4℃，14000r/min離心30min，取2mL上清液測總蛋白濃度。由于透明顫菌血紅蛋白能夠與CO結(jié)合成絡(luò)合物，在419nm處有特異的吸收峰，因此，使用低溫高壓破碎儀破碎細(xì)胞，再低溫離心細(xì)胞破碎液并取上清液，進(jìn)行CO差異光譜分析[13]。向待測蛋白樣品中連續(xù)通2min的CO，再利用Evolution220型可見分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]進(jìn)行全波長(400～500nm)掃描。

　　1.7搖瓶發(fā)酵

　　將出發(fā)菌株NP11和重組菌株NG-20,NG-21和NG-22，分別劃線于YPD平板，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。分別挑單克隆接種于50mLYPD培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下培養(yǎng)24h;再將種子液分別轉(zhuǎn)接至裝有50,100mLNL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，初始OD控制為0.1，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下發(fā)酵至發(fā)酵液殘?zhí)菨舛刃∮?0g/L，收集細(xì)胞稱取細(xì)胞干重，再利用酸熱法提取油脂進(jìn)行后續(xù)分析。

　　1.8Westernblot分析

　　取2mL在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的NP11和3種工程菌株，于8000r/min離心5min，棄上清，再用雙蒸水清洗一遍;加入200μL細(xì)胞裂解液以及適量玻璃珠，利用FastPrep○R-24細(xì)胞破碎儀[安諾論(北京)生物技術(shù)有限公司]振蕩1min(4.0M/s)，冰浴1min，重復(fù)5次;取60μL細(xì)胞破碎之后的上清液加入20μL4×loadingbuffer,98℃處理10min，取10μL處理過的樣品上樣(8%分離膠)，15mA限流的條件下進(jìn)行電泳。通過濕法轉(zhuǎn)膜，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上(100mA限流，電泳50min);然后將膜37℃封閉1h，膜清洗液清洗3次，每次5min。一抗采用抗His-Tag單克隆抗體(購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;二抗選擇山羊抗小鼠IgG抗體(購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育1h，膜清洗液清洗3次，每次5min;添加顯色液進(jìn)行顯色，使用Tanon-5200Multi全自動化學(xué)發(fā)光圖像處理系統(tǒng)分析(上海天能科技有限公司)Westernblot結(jié)果。

　　1.9細(xì)胞顯微觀察

　　分別取50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)發(fā)酵液發(fā)酵終點(diǎn)時的菌液，利用EVOS顯微鏡(北京東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行鏡鑒，觀察出發(fā)菌株與工程菌株的細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)油脂積累的情況。

　　2、結(jié)果與分析

　　2.1工程菌株vgb基因型驗(yàn)證

　　通過ATMT的方法將vgb整合至圓紅冬孢酵母染色體中，使用位于啟動子的上游引物GPD-795-F與位于終止子的下游引物Thsp-129-R進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果如圖1所示。

　　圖1基因型鑒定

　　從圖1可以看出，出發(fā)菌株NP11無條帶，而3種重組菌株NG-20,NG-21和NG-22均具有預(yù)期大小的目的條帶，這表明透明顫菌血紅蛋白基因vgb已成功整合到圓紅冬孢酵母染色體上。

　　2.2透明顫菌血紅蛋白的表達(dá)及活性功能的檢測

　　Westernblot和CO差異光譜分析的結(jié)果如圖2所示。本文使用Westernblot分析VHb蛋白在重組菌株中的表達(dá)。從圖2(a)中可以看出，在工程菌株泳道中有一條清晰的VHb蛋白(VHb蛋白單體的理論大小為15.7kDa)的免疫雜交條帶，說明重組菌株可以正常合成VHb蛋白。VHb在不同的環(huán)境條件下可呈現(xiàn)3種不同的狀態(tài)，若向含酶溶液中鼓入CO氣體，則可形成VHb-CO復(fù)合物，在419nm處呈現(xiàn)特征吸收峰。為了檢測VHb在圓紅冬孢酵母中是否具有生物活性，利用CO差異光分析方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2(b)所示[14]。從圖2(b)中可以看出，3個重組菌株NG-20,NG-21和NG-22在419nm處均具有吸收峰，而出發(fā)菌株NP11沒有吸收峰，3個重組菌株間的吸光度有所差別，這可能與VHb蛋白的表達(dá)量不同有關(guān)。綜上可知，透明顫菌血紅蛋白在圓紅冬孢酵母胞內(nèi)成功表達(dá)并且具有一定的生物活性。

　　圖2Westernblot和CO差異光譜分析

　　2.3VHb對油脂積累的影響

　　在本研究中，為了充分驗(yàn)證透明顫菌血紅蛋白對圓紅冬孢酵母油脂積累的影響，將發(fā)酵液的體積分別控制在50mL(模擬不限氧條件)和100mL(模擬限氧條件)，在容量為250mL的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果分別如圖3,4所示。

　　圖3發(fā)酵液的體積為50mL時，VHb對油脂積累的影響

　　圖4發(fā)酵液體積為100mL時，VHb對油脂積累的影響

　　從圖3中可以看出：在不限氧條件下，NG-20的葡萄糖消耗最少，其他重組菌株的葡萄糖消耗無明顯差異;出發(fā)菌株NP11的油脂產(chǎn)量為8.04g/L，油脂產(chǎn)率為57%,3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產(chǎn)量分別為8.31,9.47,8.25g/L，油脂產(chǎn)率分別為59%,61%,58%;與出發(fā)菌株相比，NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%。

　　從圖4中可以看出：在限氧條件下，發(fā)酵至120h之后，3種工程菌株的葡萄糖消耗速率開始快于出發(fā)菌株的消耗速率;在發(fā)酵終點(diǎn)時，出發(fā)菌株的生物量為11.59g/L，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的生物量分別為12.69,11.29,13.38g/L，與出發(fā)菌株相比，NG-22的生物量增加了15.40%，這表明透明顫菌血紅蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長;出發(fā)菌株的油脂產(chǎn)量和產(chǎn)率分別為5.78g/L和50%，而3種工程菌株NG-20,NG-21和NG-22的油脂產(chǎn)量分別為7.17,5.77,7.39g/L，油脂產(chǎn)率分別為57%,51%,55%，與出發(fā)菌株相比，NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%。

　　2.4VHb對細(xì)胞形態(tài)的影響

　　在限氧和不限氧條件下，出發(fā)菌株和3種工程菌株在發(fā)酵終點(diǎn)時的細(xì)胞形態(tài)如圖5所示。

　　圖5發(fā)酵終點(diǎn)時的細(xì)胞形態(tài)圖

　　從圖5(a)可以看出，出發(fā)菌株和3種工程菌株的細(xì)胞相差不大，但是3種工程菌株的胞內(nèi)脂滴明顯大于出發(fā)菌株。從圖5(b)可以看出，3種工程菌株的細(xì)胞均大于出發(fā)菌株的細(xì)胞，并且胞內(nèi)脂滴也明顯大于出發(fā)菌株。這進(jìn)一步證明了vgb基因能夠提高胞內(nèi)氧氣的利用率并且促進(jìn)了胞內(nèi)油脂的積累及細(xì)胞生長。

　　3、討論和結(jié)論

　　在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中，細(xì)胞密度的增加須消耗更多的氧氣，將導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧量不足。透明顫菌血紅蛋白具有運(yùn)輸氧氣的功能，本研究在圓紅冬孢酵母中表達(dá)密碼子優(yōu)化后的vgb基因，發(fā)現(xiàn)在限氧和不限氧的發(fā)酵水平下，均提高了工程菌株的氧氣利用率及耐受貧氧的能力。本文的研究結(jié)果表明：在50mL的搖瓶發(fā)酵水平(不限氧條件)下，工程菌株NG-21的油脂產(chǎn)量提高了18%;在100mL的搖瓶發(fā)酵水平(限氧條件)下，工程菌株NG-22的油脂產(chǎn)量提高了28%。值得注意的是，在氧氣不足的情況下，工程菌株油脂產(chǎn)量的提高更為明顯，由此說明，透明顫菌血紅蛋白可以提高胞內(nèi)氧氣的利用率、緩解貧氧環(huán)境下的壓力。

　　在限制氧氣和不限制氧氣條件下，VHb均能夠提高圓紅冬孢酵母細(xì)胞的氧氣利用率從而促進(jìn)油脂的積累，能夠緩解因高密度發(fā)酵導(dǎo)致氧氣不足而造成的細(xì)胞死亡及產(chǎn)量下降等問題;同時，降低了機(jī)械力對細(xì)胞的損害，延長了設(shè)備的使用壽命，縮短了發(fā)酵時間，在大規(guī)模發(fā)酵過程中，具有一定的應(yīng)用前景。

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