維氏氣單胞菌隸屬弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，為革蘭陰性桿菌，兼性厭氧型。氣單胞菌廣泛存在于各種水體生態(tài)系統(tǒng)中，比如淡水、沿海水域以及污水中［1］，能夠經(jīng)常從腹瀉的人類［2］以及出血性敗血癥的魚類中分離到［3］。研究表明，嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌以及維氏氣單胞菌為3種主要的致病性氣單胞菌，涵蓋了氣單胞菌中85%的臨床病癥來源［4］。目前在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖上，對(duì)于氣單胞菌致病性的研究主要為嗜水氣單胞菌［5］，對(duì)維氏氣單胞菌的致病性及分布關(guān)注并不多。團(tuán)頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)隸屬硬骨魚綱鯉形目鯉科鳊亞科，是我國(guó)重要的草食性經(jīng)濟(jì)魚類之一，具有味美、生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，是江蘇省南部地區(qū)的主要淡水養(yǎng)殖品種。出血病是團(tuán)頭魴養(yǎng)殖過程中危害最嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病害，通常認(rèn)為由嗜水氣單胞菌引起［6］，使用抗生素進(jìn)行防治［7］。然而，隨著養(yǎng)殖密度的擴(kuò)大、養(yǎng)殖水體的惡化以及抗生素的濫用，團(tuán)頭魴出血病呈常發(fā)、難治的態(tài)勢(shì)。本研究在江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)某團(tuán)頭魴養(yǎng)殖塘剛剛出現(xiàn)出血病后，即對(duì)該塘口的不同生態(tài)位進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定及人工感染試驗(yàn)，同時(shí)分析菌株的毒力基因及耐藥性，以期為團(tuán)頭魴出血病的發(fā)病機(jī)理及分子流行病學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為該病的防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1發(fā)病塘口及菌株

2010年7月11日常州武進(jìn)某團(tuán)頭魴池塘出現(xiàn)大批團(tuán)頭魴死亡的情況。塘口檢查發(fā)現(xiàn)病魚游動(dòng)緩慢，攝食減少，腸道內(nèi)食糜少或無，體表腹部、尾鰭以及鰓部有出血點(diǎn)，部分有大面積的皮膚潰爛。解剖檢查發(fā)現(xiàn)一部分病魚肝臟發(fā)白、腫大，一部分有溶血性腹水。采集該池塘病魚21尾，利用選擇性培養(yǎng)基分離細(xì)菌，分離位點(diǎn)包括魚的腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等。同時(shí)采集該池塘的水樣、底泥，利用選擇性培養(yǎng)基分離水體、浮游生物和底泥中的細(xì)菌。

1．2主要試劑及培養(yǎng)基

細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，RS培養(yǎng)基［8］、LB培養(yǎng)基為本課題組配制。

1．3細(xì)菌的分離、篩選

病魚腸道、體表黏液、鰓、腹腔、肝臟、腎臟等位點(diǎn)用接種環(huán)劃線RS固體培養(yǎng)基;將池塘水經(jīng)25μm的膜或者濾紙過濾后，水體位點(diǎn)的菌株用過濾后的水涂RS培養(yǎng)基;浮游生物位點(diǎn)則是將濾紙浸入無菌生理鹽水、振蕩后，劃線RS固體培養(yǎng)基;底泥經(jīng)無菌生理鹽水稀釋后涂RS培養(yǎng)基。RS培養(yǎng)接種后，28℃培養(yǎng)24h。隨機(jī)挑選5個(gè)單菌落劃線接種LB固體平板。用氧化酶、接觸酶、O/F、鳥氨酸脫羧酶對(duì)單菌落作進(jìn)一步篩選，鳥氨酸脫羧酶陽性為維氏氣單胞菌區(qū)別與其他氣單胞菌的主要生化特性［9］。對(duì)4個(gè)生化指標(biāo)都為陽性的菌株接種LB液體，28℃培養(yǎng)24h后，用15%液體甘油－80℃保存?zhèn)溆谩?

1．4維氏氣單胞菌鑒定

1．4．1細(xì)菌DNA模板的制備

將保存在－80℃中的菌株，接種LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18h，離心收集菌體，參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA，作為DNA模板。

1．4．2維氏氣單胞菌管家基因測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)氣單胞菌16SrDNA和管家基因gyrB，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定細(xì)菌菌株。16SrDNA引物為AER－F(5'－CTACTTTTGCCGGCGAGCGG－3');AER－R(5'－TGATTCCCGAAGGCACTCCC－3')［10］由上海生工合成。反應(yīng)條件:94℃變性2min;接著30個(gè)循環(huán):94℃30s，58℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產(chǎn)物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，片段大小953bp。有目的片段則判斷該菌株為氣單胞菌屬。管家基因gyrB擴(kuò)增引物:gyrB－3F(5'－TCCGGCGGTCTGCACGGCGT－3')和gyrB－14R(5'－TTGTCCGGGTTGTACTCGTC－3')［11］由上海生工合成。反應(yīng)條件:94℃變性2min;接著30個(gè)循環(huán):94℃30s，59℃30s，72℃90s;最后72℃延伸10min。取2μLPCR產(chǎn)物，用1．2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，片段大小為1100bp。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工序列測(cè)序。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將測(cè)序菌株的gyrB序列用Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)的親近物種進(jìn)行相似性分析，并用Mega4．1中的Neighbor－Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1．4．3維氏氣單胞菌的生化特性

將菌株接種生化培養(yǎng)管后，28℃培養(yǎng)24h，觀察并記錄結(jié)果。生化特性包括賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、硝酸鹽(還原)、硫化氫、明膠、葡萄糖、乳糖、β－半乳糖苷(ONPG)、山梨醇、赤鮮醇、衛(wèi)矛醇、丙二酸鹽等。

1．5維氏氣單胞菌的人工感染

對(duì)確定為維氏氣單胞菌的菌株進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，驗(yàn)證其致病性。具體方法為:將菌株單菌落接種LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)20h，將細(xì)菌濃度稀釋為109CUF/mL。每個(gè)菌株腹部肌肉注射5尾魚，魚體重(100±3)g，注射劑量為每100g魚體重0．5mL菌株。然后觀察魚的發(fā)病、死亡情況，統(tǒng)計(jì)24h、48h的死亡率，并對(duì)人工感染后具有典型癥狀的死魚進(jìn)行拍照、解剖以及優(yōu)勢(shì)菌的分離鑒定。

1．6維氏氣單胞菌毒力基因的檢測(cè)

用PCR檢測(cè)氣單胞菌的2種主要毒力基因。溶血素基因hly，片段大小597bp。引物為hly－F(5'－GGCCGGTGGCCCGAAGATACGGG－3')和hly－R(5'GGCGGCGCCGGACGAGACGGG－3')［12］。反應(yīng)條件:94℃變性3min，接著30個(gè)循環(huán):92℃30s，65℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。細(xì)胞興奮性腸毒素基因alt，片段大小442bp。引物為alt－F(5'－TGACCCAGTCCTGGCACGGC－3')和alt－R(5'－GGTGATCGATCACCACCAGC－3')［13］。反應(yīng)條件:94℃變性3min;接著30個(gè)循環(huán):92℃30s，60℃30s，72℃60s;最后72℃延伸10min。