作者：郭曉青 吳金鴻 周焱富 王正武 楊科峰 單位：上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 貴陽護理職業(yè)學(xué)院 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)系

1材料與方法

1.1材料與試劑明日葉由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院種植實驗基地提供。AB-8大孔樹脂、DM130大孔樹脂、HP-20大孔樹脂，蘆丁標準品（純度>98%）上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，95%乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備RT-25粉碎機北京興時利和科技發(fā)展有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司；AG823LC7-NRHE微波爐廣東美的微波爐制造有限公司；離心機Centrifuge5810Reppendorf；DU800uv/visSpectrophotometerBeckmanCoulter，USA；SHA—B雙功能水浴恒溫振蕩器金壇市科析儀器有限公司；DHL-B電腦恒流泵上海青浦滬西儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽上海青浦滬西儀器廠；FD-1A-50冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1明日葉水溶性總黃酮含量測定

1.3.1.1標準曲線繪制準確秤取蘆丁標準品5mg，用95%乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)移至25mL棕色容量瓶中，配成0.20mg/mL的蘆丁標準溶液。準確取蘆丁標準溶液（0.2mg/mL）0.00、0.20、0.40、0.60、1.00、1.20mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%NaNO20.4mL，搖勻，放置6min，再加入10%Al（NO3）30.4mL，搖勻，放置6min，再加入5%NaOH4mL，加水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白作為參比，在510nm處測定吸光度A，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[9-10]，得到蘆丁吸光度與濃度的標準曲線回歸方程y=6.7558x-0.0036R2=0.9942。蘆丁濃度在0—0.024mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.3.1.2明日葉水溶性總黃酮含量測定取1mL樣品液，稀釋10倍，再取1mL稀釋液，按標準曲線建立的方法測定吸光度，根據(jù)公式（1）求出樣品液總黃酮含量。

1.3.2明日葉水溶性總黃酮粗提液制備將干燥明日葉粉碎至80目以下。明日葉粉按料液比1：10與去離子水混合，攪拌均勻，采用水浴加熱浸提、直接加熱煮沸浸提、微波輔助浸提三種方法浸提，浸提液冷卻至室溫后8000r/min離心10min，應(yīng)用1.3.1.2測定方法測定上清液總黃酮含量，按公式（2）計算相應(yīng)提取率。比較結(jié)果，選擇最佳浸提方法。

1.3.3.1樹脂的預(yù)處理用95%的乙醇將大孔樹脂浸泡24h，充分膨脹后，用乙醇洗至洗出液加適量的水無白色渾濁，再用去離子水洗去乙醇；然后用5%的HCl溶液浸泡5h，再用去離子水洗至中性；最后用5%NaOH溶液浸泡5h，再用去離子水洗至中性，然后浸泡在去離子水中備用[11]。

1.3.3.2大孔樹脂篩選對AB-8、DM130與HP-20三種大孔樹脂[11-12]，進行靜態(tài)吸附及解吸實驗，比較確定較理想的大孔樹脂。具體實驗步驟如下：分別取2g經(jīng)預(yù)處理的樹脂置于錐形瓶中，加入加入質(zhì)量濃度為1.557mg/mL樣液50mL，置于18℃水浴恒溫震蕩器上震蕩12h，充分吸附后將樣液靜置10min，按1.3.1.2測定上清液中的水溶性總黃酮濃度，再根據(jù)公式（3）與公式（4）分別計算總黃酮吸附量和吸附率。將上述吸附飽和的大孔樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，濾紙吸干樹脂表面殘留溶液，加入95%乙醇50mL，置35℃水浴恒溫震蕩器震蕩12h，充分解吸后將樣液靜置10min，測定洗脫液中總黃酮濃度，根據(jù)公式（5）計算解析率。

1.3.3.3大孔樹脂提純工藝的優(yōu)化用濕法將10mL樹脂裝入層析柱（1.6cm×20cm）中，取質(zhì)量濃度為2.445g/mL的一定體積的明日葉水溶性總黃酮粗提液，以1mL/min流速上樣，每1BV收集一份流出液，測定每份流出液中總黃酮含量，繪制泄露曲線，確定最佳上樣量。以最佳上樣量上樣，測定洗脫液最佳pH值、最佳洗脫濃度以及最佳洗脫用量。

1.3.4明日葉水溶性總黃酮提純產(chǎn)物分析在最佳的提純工藝條件下，收集大孔樹脂洗脫液，將其旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮，冷凍干燥，得到提純產(chǎn)物。測定提純產(chǎn)物樣品中紫外吸收光譜（波長測定范圍：200-510nm）、總黃酮含量、總糖含量[13]，并分析測定其特征性顯色反應(yīng)[14]以初步判斷其所含的黃酮類別。

1.3.5數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)以三個獨立重復(fù)實驗的平均值表示，實驗結(jié)果采用t檢驗進行統(tǒng)計分析，p<0.05時具有顯著性差異，p<0.01時具有極顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1明日葉水溶性總黃酮的浸提方法

2.1.1水浴加熱浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響在不同的浸提溫度和浸提時間的條件下水浴加熱浸提得到的粗提液水溶性總黃酮提取率分析結(jié)果分別見圖2和圖3。由圖2可知，水浴加熱浸提10min，隨著溫度升高浸提液中水溶性總黃酮提取率升高，溫度達到75℃,總黃酮提取率顯著增加（p<0.05）,95℃時總黃酮提取率達到最大值，為2.52%。由圖3可知，在水浴95℃條件下浸提，隨著加熱時間增加，總黃酮提取率先增加，浸提10min時浸提液總黃酮提取率達到最大值(p<0.05)，隨后總黃酮提取率逐漸降低。因此，水浴加熱浸提的最佳條件是95℃水浴加熱10min。

2.1.2加熱煮沸浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響由圖4可知，隨著煮沸浸提時間增加，總黃酮含量先增加，沸騰狀態(tài)下浸提5min時浸提液總黃酮含量顯著增加（p<0.05），隨后增加趨緩，5min—10min（p>0.05）,浸提10min后總黃酮含量顯著降低(p<0.05)。因此，直接加熱煮沸最佳浸提時間是5min。由結(jié)果可以看出，95℃水浴加熱10min浸提提取率最大。同時，兩種方法浸提10min后浸提液中總黃酮提取率反而降低。這是因為黃酮苷元本身難溶于水或不溶于水，但當引入羥基或糖苷變成黃酮苷類物質(zhì)后后極性增大，在水中溶解度增加[14]。明日葉中含有較多的水溶性黃酮糖苷類物質(zhì)，但在較高加熱溫度下，加熱時間過長時容易使黃酮糖苷類發(fā)生了水解，轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，從而降低了在水中的溶解度，導(dǎo)致水溶性黃酮含量減少。同時黃酮苷類的水解情況根據(jù)糖的種類和鏈接在糖的母核上的位置不同而不同，有的水解只需幾分鐘，而有的則需幾小時[14]，這也是不同浸提時間增加，水溶性黃酮提取率不同的主要原因。

2.1.3微波輔助浸提對明日葉水溶性總黃酮提取率的影響據(jù)有關(guān)文獻報道，加熱浸提后再進行微波輔助提取，黃酮提取率會大幅度增加[15]。95℃水浴加熱10mim后，進行微波輔助浸提，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可知，95℃水浴加熱10mim后，再進行微波輔助提取，總黃酮提取率沒有明顯增加（p>0.05），而且助提3次后總黃酮含量還明顯降低了（p<0.05）。綜合以上實驗結(jié)果，結(jié)合經(jīng)濟效益與提取率等因素，本文確定最適的浸提方法為水浴加熱浸提，最佳浸提條件為浸提溫度為95℃，浸提時間為10min。