作者：趙梅 張紹鈴 齊開杰 衡躍進(jìn) 陶書田 單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心 寶應(yīng)縣奕佳農(nóng)牧有限公司

實(shí)驗(yàn)方法

挑選健康的幼果，去皮去核，果肉切成小塊，液氮研磨成粉末，稱取一定質(zhì)量的粉末，按一定的提取條件在恒溫?fù)u床中勻速浸提，將粗提液離心過濾后，測(cè)定并計(jì)算多酚得率。梨幼果多酚含量的測(cè)定采用福林酚法（Folin-Ciocalteu）[6]測(cè)定，以沒食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算梨幼果多酚含量。回歸方程為y=8.5095x+0.0111，R2=0.9984。梨幼果多酚得率的計(jì)算多酚得率/(mg/g)=C×V×N/m，式中：C為提取液中多酚質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；m為梨幼果果肉質(zhì)量（g）。梨幼果多酚提取的單因素試驗(yàn)選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比為影響因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響采用不同的乙醇濃度10%、30%、50%、70%、90%，固定提取時(shí)間5h，提取溫度60℃，提取料液比1:20（g/mL），研究不同乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響采用不同的提取時(shí)間2、4、6、8、10、12h，固定乙醇濃度50%，提取溫度60℃，提取料液比1:15(g/mL)，研究不同提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響。提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響采用不同提取溫度20、40、60、80、100℃，固定乙醇濃度50%，提取時(shí)間1.5h，料液比1:20（g/mL），研究不同提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。

料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響采用不同提取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，固定乙醇濃度50%，提取時(shí)間5h，提取溫度60℃，研究不同提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響。梨幼果多酚提取的正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響，設(shè)計(jì)4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)。梨幼果酚類物質(zhì)HPLC分析提取物經(jīng)過0.45μm微濾膜過濾后，利用色譜儀進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜分析條件[4]：色譜柱，C18柱150mm×4.6mm，Φ5μm；流動(dòng)相，甲醇和水；柱溫，30℃；流速，0.6mL•min-1；進(jìn)樣量，5μL；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)280nm。流動(dòng)相A：水，用磷酸調(diào)pH3.2；B：甲醇。線性梯度淋洗程序，時(shí)間（min）/B（%）：0/2，3/2，4/25，11/50，16/80，26/80，30/2，35/2。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用Excel和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果與分析

1提取條件的單因素試驗(yàn)

1.1乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響由圖1可以看出乙醇濃度低于70%時(shí)，隨著乙醇濃度增加，梨幼果多酚得率也逐漸提高；乙醇濃度高于70%時(shí)，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而下降。乙醇濃度過低，多酚得率低，可能是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)在植物體內(nèi)通常與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，而水?dāng)嗔褮滏I的作用較弱，提取液中水的比例過高時(shí)，不足以破壞樣品中多酚類物質(zhì)與蛋白、多糖或其他物質(zhì)的連接，多酚得率低[7]；乙醇濃度過高，多酚得率低，可能是因?yàn)槿艹鲚^多醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性較強(qiáng)的成分，這些成分與多酚類化合物競(jìng)爭(zhēng)同一乙醇水分子[8]。乙醇濃度為50%和70%時(shí)，多酚得率之間沒用顯著性差異，考慮到工業(yè)成本，確定最佳乙醇濃度為50%。

1.2提取時(shí)間對(duì)梨幼果多酚得率的影響如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4h，多酚得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多酚得率開始下降。這是因?yàn)殡S著時(shí)間加長(zhǎng)，可以使多酚充分溶解于溶劑中，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)因?yàn)闇囟鹊挠绊懓l(fā)生降解、縮合、氧化等化學(xué)反應(yīng)[9]。此外，時(shí)間越長(zhǎng)，耗能越大[10]，故選擇最佳提取時(shí)間為4h。

1.3提取溫度對(duì)梨幼果多酚得率的影響由圖3可知在所設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)，多酚得率隨溫度的升高而呈增大趨勢(shì)。在20～40℃之間，多酚得率上升速率最慢，40～60℃之間，多酚得率的升高最明顯，60～100℃之間，多酚得率的增量有所下降。可能是由于隨著溫度的升高，一方面有利于未游離出來的多酚的浸出[11-12]，另一方面，也促進(jìn)已經(jīng)提取出來的多酚的氧化與降解[13]。故綜合考慮選擇最佳提取溫度為60℃。

1.5料液比對(duì)梨幼果多酚得率的影響由圖4可以看出，隨著料液比的增大，多酚得率逐漸增加,當(dāng)料液比到達(dá)1:25以后，料液比繼續(xù)增大，多酚得率增加緩慢。這可能是由于料液比為1:25時(shí)，溶劑已經(jīng)能將梨幼果中多酚提取出來，繼續(xù)增加料液比，并不能顯著提高多酚得率。而且料液比過高，不利于回收，且造成浪費(fèi)。因此，從提取效果、經(jīng)濟(jì)角度方面考慮，料液比選擇1:25較為合適。

2正交試驗(yàn)優(yōu)化梨幼果多酚提取條件

通過各因素的極差R（表2）比較發(fā)現(xiàn)RB>RA>RD>RC，極差R越大，其對(duì)應(yīng)因素對(duì)梨幼果多酚得率影響越大。因此，本試驗(yàn)影響因子的先后順序?yàn)樘崛囟?gt;乙醇濃度>提取料液比>提取時(shí)間。將極差最小的因素（提取時(shí)間）作為誤差項(xiàng)，方差分析（表3）進(jìn)一步表明，提取溫度和乙醇濃度是影響幼果多酚得率的主要因素。梨幼果多酚提取最佳提取組合為A3B3C1D3，即乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此組合進(jìn)行提取試驗(yàn)，多酚得率可達(dá)到1.47mg/g。

3梨幼果多酚物質(zhì)HPLC分析結(jié)果

利用高效液相色譜法可以較好地分離各種酚類成分，標(biāo)樣中11種組分的出峰順序依次為熊果苷、沒食子酸、兒茶素、綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、香草醛、阿魏酸、蘆丁、根皮苷、槲皮素（圖5-A）。梨幼果樣品中測(cè)定出9種酚類物質(zhì)（圖5-B），未檢測(cè)到根皮苷和槲皮素。檢測(cè)出的酚類物質(zhì)中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%；兒茶素、綠原酸、香草醛含量較高，為主要的酚類物質(zhì)；沒食子酸含量最低。

結(jié)論

本文對(duì)梨幼果多酚提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用高效液相色譜分析其組分，為梨果實(shí)酚類物質(zhì)代謝研究和生物資源的利用提供了可靠的理論依據(jù)和技術(shù)方法。正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果表明提取溫度、乙醇濃度對(duì)梨幼果多酚得率的影響是顯著的，最佳提取工藝組合：乙醇濃度60%，提取溫度70℃，提取時(shí)間2h，提取料液比1:30（g/mL），依照此水平進(jìn)行提取試驗(yàn)，多酚得率可達(dá)到1.47mg/g。通過高效液相色譜分析可知，梨幼果主要含有熊果苷、兒茶素、綠原酸、香草醛等多酚物質(zhì)，其中熊果苷含量最高，為總含量的74.1%。熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶活性，抑制皮膚黑色素的形成，是目前國(guó)內(nèi)外美白化妝品中的主要原料[14]。因此，梨幼果可作為化妝品美白劑熊果苷的天然原料，是潛在的生物資源。