作者：沈海萍 樸永哲 祖國(guó)仁 夏先鋒 趙長(zhǎng)新 單位：大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院

國(guó)際上，丹麥學(xué)者論證了混菌發(fā)酵中釀酒酵母CCMI885蛋白類(lèi)分泌物對(duì)幾種非釀酒酵母具有拮抗作用，并且用單項(xiàng)電泳分離出分子量在2~10ku的蛋白毒素[10]。國(guó)內(nèi)，翟明昌等[11]發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母FFC2144的存在導(dǎo)致了克魯維酵母FCC2116的提前死亡，并排除空間爭(zhēng)奪、溶氧、酒精度、pH、氮源等因素，確定是釀酒酵母的分泌蛋白導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡，并指出釀酒酵母大分子量分泌蛋白對(duì)克魯維酵母也具有拮抗作用；并采用雙向電泳方法研究了克魯維酵母非程序衰亡的胞內(nèi)蛋白組表征[12]。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙向電泳技術(shù)，從蛋白組學(xué)層面進(jìn)一步研究釀酒酵母分泌的哪些蛋白導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡，并試圖揭示釀酒酵母產(chǎn)生抑菌蛋白的機(jī)制。

材料與方法

1.1材料與儀器釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeFFC2144）大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心；耐熱克魯維酵母（KluyveromycesThermotoleransFCC2116）大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心；培養(yǎng)基采用改良的全合成培養(yǎng)基（L）[13]40g葡萄糖，6g檸檬酸，6gDL-蘋(píng)果酸，1.5g酒石酸，6.7gYNB（Yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，Difco），10g（NH4）2SO4，0.5g色氨酸，0.5g組氨酸，0.5g精氨酸，pH3.3。圓盤(pán)式電泳儀及垂直板電泳槽北京六一廠；1L螺口瓶紗布封口。

1.2菌體培養(yǎng)培養(yǎng)條件：28℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min。透析培養(yǎng)：將克魯維酵母接種于透析袋（截留分子量為10ku）的內(nèi)部，接種后袋內(nèi)共計(jì)15mL發(fā)酵液，釀酒酵母接種于透析袋的外部，接種后袋外共計(jì)485mL發(fā)酵液，接種濃度均為1×104cfu/mL。

1.3菌體生長(zhǎng)曲線測(cè)定自接種時(shí)刻開(kāi)始，每5h在無(wú)菌室取發(fā)酵液，稀釋涂平板（YPDA培養(yǎng)基[12）]，培養(yǎng)12~24h，單菌落計(jì)數(shù)，并合算成該時(shí)間段的菌體濃度（cfu/mL）。

1.4蛋白提取根據(jù)釀酒酵母FFC2144菌體濃度（生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期）、殘?zhí)荹14（]少于2g/L）及酵母細(xì)胞完整性，選擇發(fā)酵60h為釀酒酵母FFC2144胞外蛋白提取時(shí)間。胞外蛋白提取方法-超濾法：發(fā)酵液于6000r/min離心，得上清液。上清液用10ku的超濾膜冰浴濃縮，雙蒸水多次沖洗以去掉雜質(zhì)及小分子物質(zhì)，再通過(guò)反沖洗濾膜，將截留的大分子物質(zhì)沖洗下來(lái)。將蛋白濃縮液冷凍干燥，待用。

1.5抑菌實(shí)驗(yàn)離心后的發(fā)酵上清液用超濾方法除去糖、酸、醇、酯等較小分子量物質(zhì)，并且通過(guò)冷凍干燥法將其體積從的150mL左右體積的溶液濃縮到約10mL，將得到的胞外蛋白濃縮液加入到剛剛接種的克魯維酵母FCC2116的純菌發(fā)酵液中，進(jìn)行培養(yǎng)。動(dòng)態(tài)觀測(cè)克魯維酵母的生長(zhǎng)情況（即各時(shí)段菌體濃度）。

1.6雙向電泳樣品制備：在冰浴條件下，將凍干的蛋白溶解于適量的蛋白溶解液（8mol/L尿素，50mmol/LDTT，5%Triton×100，2.5%pH4~6兩性電解質(zhì)，0.5%pH3~10兩性電解質(zhì)）中，并輔助超聲及漩渦振蕩促進(jìn)溶解。目測(cè)蛋白溶解后，于13000r/min離心10min，取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定溶解液中蛋白濃度，添加新鮮溶解液，混勻，使各樣品蛋白終濃度為150μg/15μL（上樣量），并按上樣量分裝，冷凍保藏。上樣前樣品中加入微量溴酚藍(lán)指示劑，充分混勻。膠條制作：在王祥余等[15]方法基礎(chǔ)上略加修改，注膠量不以體積計(jì)，而保證每根膠長(zhǎng)度為7cm。等電聚焦條件：200V0.5h，500V1h，1350V4h；每次升高電壓時(shí)，按約200V/min速度勻速緩慢提升電壓。平衡條件：兩步平衡。平衡液1∶6mol/L尿素，2%SDS，100mmol/LTris（pH8.8），30%甘油，1%DTT，15min；平衡液2∶6mol/L尿素，2%SDS，100mmol/LTris（pH8.8），30%甘油，2%碘乙酰胺，15min。SDS-PAGE：5%的濃縮膠，12%分離膠。染色方法：Neuhoff考染法[16]。

1.7凝膠圖像分析凝膠通過(guò)BINTA2020D型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，利用PDQuest8.0軟件完成對(duì)凝膠圖像的剪裁、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配、差異比較。

結(jié)果與討論

2.1釀酒酵母胞外蛋白對(duì)克魯維酵母的影響對(duì)圖1中三組關(guān)鍵差異數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，得表1（各組數(shù)據(jù)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差以±標(biāo)注）。通過(guò)Excel數(shù)據(jù)分析，空白組和純培養(yǎng)胞外蛋白添加組的p為0.2316，而空白組比對(duì)透析蛋白添加的p為0.000813＜0.05，因此可以判斷：釀酒酵母FFC2144純培養(yǎng)的大分子量蛋白（大于10ku）的添加對(duì)克魯維酵母FCC2116生長(zhǎng)影響不大，而透析培養(yǎng)得到的胞外蛋白對(duì)FCC2116有顯著影響。由此可以推斷，釀酒酵母FFC2144分泌出對(duì)魯維酵母生長(zhǎng)具有拮抗作用的蛋白類(lèi)物質(zhì)這一現(xiàn)象并非自發(fā)；即在透析培養(yǎng)中，克魯維酵母FCC2116產(chǎn)生一種小分子信號(hào)物質(zhì)，誘導(dǎo)釀酒酵母FFC2144分泌出特異蛋白。其中部分新增的特異蛋白（包含于2DE圖譜的總新增蛋白點(diǎn)中），最終導(dǎo)致了克魯維酵母的提前死亡。

2.2純培養(yǎng)和透析培養(yǎng)的釀酒酵母胞外蛋白圖譜比較通過(guò)PDQuest軟件，可對(duì)兩張雙向電泳圖譜進(jìn)行蛋白點(diǎn)總數(shù)計(jì)算、同一蛋白點(diǎn)匹配以及差異蛋白分析（本實(shí)驗(yàn)中僅對(duì)新增蛋白點(diǎn)進(jìn)行定性分析，不進(jìn)行蛋白含量的差異比較）。圖2a中，釀酒酵母FFC2144純培養(yǎng)胞外蛋白雙向電泳圖譜中共有79個(gè)點(diǎn)，主要分布在分子量大于40ku的酸性區(qū)域。圖2b中，從透析培養(yǎng)中提取的釀酒酵母FFC2144胞外蛋白雙向電泳圖譜中包含109個(gè)點(diǎn)，分布集中在分子量大于20ku的酸性和中性區(qū)域。比較圖2中a、b兩圖譜，發(fā)現(xiàn)透析培養(yǎng)蛋白圖譜上新增30個(gè)點(diǎn)，占純培養(yǎng)總蛋白種類(lèi)的54%。變化如此巨大，反映了酵母蛋白分泌對(duì)環(huán)境的靈敏度，也體現(xiàn)了胞外蛋白分泌機(jī)制對(duì)酵母環(huán)境適應(yīng)性的重大意義。增加點(diǎn)多分布于pH6~8區(qū)間，分子量在30ku以上。由2.1結(jié)果可推斷，這新增30個(gè)蛋白點(diǎn)中必包括對(duì)FCC2116的拮抗蛋白。

結(jié)論

釀酒酵母可以分泌導(dǎo)致非釀酒酵母提前死亡的分子量大于10ku的蛋白類(lèi)毒素（有別于國(guó)際上發(fā)現(xiàn)的酵母小分子量抑菌蛋白），并且這種毒素的分泌不是自發(fā)的，而是在非釀酒酵母分子量小于10ku分泌物的誘導(dǎo)作用下才會(huì)產(chǎn)生。釀酒酵母透析培養(yǎng)胞外蛋白圖譜比純培養(yǎng)圖譜新增30個(gè)蛋白點(diǎn)，其中包括對(duì)非釀酒酵母的毒蛋白。研究結(jié)果有望為釀酒酵母拮抗蛋白的相關(guān)詮釋作補(bǔ)充。