作者：趙玉秀 馬可 梁宏陽 蘇桂民 趙碩 李愛靈 張月蘭 王輝 單位：北京天壇生物制品股份有限公司

以200901批釀酒酵母蛋白為抗原，將其與等體積的弗氏完全佐劑混合，乳化，經(jīng)背部皮下多點注射免疫青紫藍家兔；2周后，用等體積的抗原與弗氏不完全佐劑混合，乳化，經(jīng)相同部位注射進行加強免疫，共加強3次。末次免疫1周后，心臟采血，分離血清。

抗釀酒酵母蛋白IgG抗體的純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法［6］純化抗釀酒酵母蛋白IgG抗體，SDS-PAGE分析抗體純度；免疫雙向擴散法測定抗體效價；Westernblot法分析抗體的特異性（分別取4、8和16μg的釀酒酵母蛋白上樣，以兔抗釀酒酵母蛋白抗體為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗）。

酶標抗體的制備采用Lowry法測定抗釀酒酵母蛋白IgG抗體的蛋白濃度，改良過碘酸鈉法［7］進行HRP標記。

雙抗體夾心ELISA法的建立參考文獻［8］。采用棋盤滴定法確定包被抗體和酶標抗體的工作濃度，對樣品孵育時間和酶標抗體反應時間等進行優(yōu)化，確定最佳反應條件。

抗原參考品標準曲線最佳線性范圍和最低檢測限的確定：將抗原參考品稀釋至400、200、100、50、25、12.5和6.25ng／ml，繪制標準曲線，經(jīng)直線回歸方程計算，確定最佳線性范圍，并確定該法的最低檢測限。

特異性驗證：用建立的雙抗體夾心ELISA法分別檢測小牛血清、人血白蛋白、MEM培養(yǎng)基、Vero細胞上清蛋白、乙型腦炎純化疫苗、凍干人用狂犬病疫苗樣品，驗證該方法的特異性。

準確度和精密度驗證：用建立的雙抗體夾心ELISA法檢測不同濃度的釀酒酵母蛋白抗原參考品（200、100、50、25、12.5、6.25ng／ml），重復10次，計算回收率和變異系數(shù)（CV），驗證方法的準確度和精密度。

適用性驗證：用建立的雙抗體夾心ELISA法測定200906231、200906232和200906233批釀酒酵母重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)各工序樣品（由本公司乙肝疫苗室提供）中釀酒酵母HCP，驗證該法的適用性。釀酒酵母蛋白抗原參考品的含量經(jīng)Lowry法測定3批釀酒酵母抗原蛋白的平均含量分別為1.61、1.64和1.63mg／ml。

抗釀酒酵母IgG抗體的鑒定純化的抗體經(jīng)SDS-PAGE分析，純度為91.7％；經(jīng)免疫雙向擴散法測定抗體效價為1∶64；Westernblot分析表明，純化的抗體能與釀酒酵母蛋白多數(shù)條帶結(jié)合，具有良好的特異性，見圖1。

雙抗體夾心ELISA法反應條件的優(yōu)化經(jīng)棋盤滴定法確定抗釀酒酵母IgG抗體的包被濃度為20μg／ml，酶標抗體的工作濃度為1∶2000，樣品孵育時間和酶標抗體反應時間分別為60和40min。

抗原參考品的最佳線性范圍和最低檢測限：釀酒酵母抗原參考品的標準曲線見圖2，最佳線性范圍為6.25～200ng／ml，最低檢測限為6.25ng／ml。2.4.2特異性：用建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測小牛血清、人血白蛋白、MEM培養(yǎng)基、Vero細胞上清蛋白、Vero細胞乙型腦炎疫苗及PHK細胞狂犬疫苗，均無特異性反應，表明該方法特異性良好。

準確度和精密度：檢測不同濃度的抗原參考品回收率在97.6％～107.00％之間，變異系數(shù)均＜10％；檢測6.25和12.5ng／ml的抗原參考品回收率低，變異系數(shù)大，不能作為定量測定。見表1。因此最低定量檢測限為25ng／ml，低于25ng／ml只能做定性檢測。

適用性：檢測結(jié)果表明，3批乙型肝炎疫苗各生產(chǎn)工序中的釀酒酵母HCP均呈下降趨勢，表明該方法可有效地反映出各工序中釀酒酵母HCP含量，見表2。

目前，以釀酒酵母為宿主的生物制品有重組乙型肝炎疫苗、注射用重組人干擾素α2a、α2b等。重組乙型肝炎疫苗（釀酒酵母）采用免疫印跡法檢測其純度；注射用重組人干擾素α2a、α2b（釀酒酵母）則采用《中國藥典》三部（2010版）方法測定菌體蛋白殘留量。酶聯(lián)免疫法測定酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品，與免疫印跡法相比，耗時短，操作簡單。本文建立的檢測生物制品中釀酒酵母蛋白殘留量的方法若制作成酶標試劑盒，則會填補國內(nèi)的空缺。

本實驗依據(jù)釀酒酵母重組疫苗的生產(chǎn)工藝制備了3批釀酒酵母蛋白，并制備了釀酒酵母蛋白參考品。以釀酒酵母蛋白為抗原免疫家兔，制備了兔抗釀酒酵母血清，采用辛酸-硫酸銨沉淀法，純化獲得了兔抗釀酒酵母蛋白IgG，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析，制備酶標抗體，建立了釀酒酵母ELISA雙抗體夾心法，經(jīng)驗證，線性關(guān)系良好，最低檢測限為6.25ng／ml，最低定量檢測限度為25ng／ml，精密度及準確度良好，有望開發(fā)為酵母細胞HCP定量檢測試劑盒。