同義替換速率（ｄＳ）或非同義替換的速率（ｄＮ）是一年中或一個(gè)世代內(nèi)一個(gè)同義位點(diǎn)上發(fā)生同義替換的數(shù)目或一個(gè)非同義位點(diǎn)上發(fā)生非同義替換的數(shù)目。實(shí)際上，由于不知道２個(gè)序列的分歧時(shí)間，因此，習(xí)慣上總是考慮一對(duì)序列的平均每個(gè)同義位點(diǎn)上發(fā)生同義替換的數(shù)目或平均每個(gè)非同義位點(diǎn)上發(fā)生非同義替換的數(shù)目。ｄＳ等于ｄＮ時(shí)（即ω＝１），表明沒(méi)受到自然選擇；ｄＳ大于ｄＮ時(shí)（ω＜１）表明受到負(fù)選擇；ｄＳ小于ｄＮ時(shí)（ω＞１）表明受到正選擇［１］。光敏色素（Ｐｈｙ）是一類(lèi)紅光／遠(yuǎn)紅光受體，在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都起重要的調(diào)節(jié)作用［２－４］。Ｐｈｙ分子是由大約１１００個(gè)氨基酸殘基的脫輔基蛋白和１個(gè)線性的四吡咯環(huán)生色團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵鏈接構(gòu)成。其Ｎ端是光感受區(qū)，包括后色膽素裂解酶亞結(jié)構(gòu)域（Ｂｉｌｉｎｌｙａｓｅｄｏｍａｉｎ，ＢＬＤ）和光敏色素亞結(jié)構(gòu)域（Ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅｄｏｍａｉｎ，ＰＨＹ），ＧＡＦ（ｃＧＭＰ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ／ａｄｅｎｙｌａｔｅｃｙｃｌａｓｅｓ／ｆｏｒｍａｔｅｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）結(jié)構(gòu)域包含于ＢＬＤ結(jié)構(gòu)域中，是發(fā)色團(tuán)結(jié)合的部位，高度保守［５－６］；Ｃ端是光調(diào)節(jié)區(qū)，光調(diào)節(jié)區(qū)域含有２個(gè)ＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）同源重復(fù)序列和１個(gè)組氨酸激酶類(lèi)作用區(qū)（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｄｏｍａｉｎ，ＨＫＲＤ）。研究表明，ＧＡＦ結(jié)構(gòu)域某些位點(diǎn)發(fā)生突變，可能會(huì)嚴(yán)重影響脫輔基蛋白和發(fā)色團(tuán)的結(jié)合［７］，從而影響光敏色素的生理功能。試驗(yàn)的前期研究發(fā)現(xiàn)，在裸子植物ＰＨＹ進(jìn)化過(guò)程中，ＧＡＦ結(jié)構(gòu)域中存在２個(gè)正選擇位點(diǎn)［８］，但是并未涉及Ｃ端的其它結(jié)構(gòu)域。ＰＨＹＢ存在于被子植物，和裸子植物中的ＰＨＹＰ同為Ｂ類(lèi)光敏色素基因。Ｙａｎｇ等［９］和Ｍａｔｈｅｗｓ等［１０］在對(duì)被子植物光敏色素Ａ－Ｃ／Ｆ基因以及光敏色素Ｂ－Ｄ／Ｅ基因的分析中檢測(cè)到了正選擇。但是Ｙａｎｇ等選用的基因序列有限，每個(gè)光敏色素類(lèi)型只有１條基因序列。樣本的大小可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。因此，現(xiàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用１６條光敏色素基因序列，檢測(cè)了分別存在于裸子植物和被子植物中同為Ｂ類(lèi)光敏色素的ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ基因的光感受區(qū)，以期了解這２個(gè)基因的光感受區(qū)是否經(jīng)歷選擇壓力以及經(jīng)歷同樣的選擇壓力，從而深化對(duì)該區(qū)域功能的認(rèn)識(shí)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用了８條裸子植物的ＰＨＹＰ光感受區(qū)序列，８條被子植物的ＰＨＹＢ光感受區(qū)序列進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析。其中被子植物的序列數(shù)據(jù)以及外類(lèi)群風(fēng)兜地錢(qián)（ＭａｒｃｈａｎｔｉａｐａｌｅａｃｅａＢｅｒｔｏｌ．ｖａｒ．ｄｉｐｔｅｒａ（Ｍｏｎｔ．）Ｈａｔｔ．）的序列數(shù)據(jù)取自ＧｅｎＢａｎｋ（序列名稱(chēng)及登陸號(hào)見(jiàn)表１）；裸子植物序列由測(cè)序所得，植物材料均采自中國(guó)科學(xué)院武漢植物園。

１．２總ＤＮＡ提取、ＰＣＲ、克隆和測(cè)序

用于ＤＮＡ提取的材料為新鮮的葉片，方法采用改進(jìn)的ＣＴＡＢ法［１１］。擴(kuò)增ＰＨＹＰ光感受區(qū)序列采用的引物是根據(jù)王靜得到的南方紅豆杉ＰＨＹＰ序列（數(shù)據(jù)未發(fā)表）和歐洲赤松ＰＨＹＰ的ｃＤＮＡ序列（Ｘ９６７３８）設(shè)計(jì)，引物為２對(duì)（表２），第１對(duì)擴(kuò)增ＢＬＤ結(jié)構(gòu)域的序列，第２對(duì)擴(kuò)增了ＰＨＹ－ＰＡＳ１結(jié)構(gòu)域的序列。測(cè)序完成后，光感受區(qū)域序列由這２個(gè)部分通過(guò)Ｅｄｉｔｓｅｑ軟件拼接而成。每２５μＬＰＣＲ反應(yīng)體系中包括：模板５０ｎｇ，引物各８ｐｍｏｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶２Ｕ（Ｔａｋａｒａ，大連）和由Ｔａｋａｒａ提供的１０倍ＰＣＲ緩沖液２．５μＬ及２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．５μＬ。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）在ＢｉｏｍｅｔｒａＰＣＲ擴(kuò)增儀上進(jìn)行（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｏ，德國(guó)）。ＰＣＲ反應(yīng)程序?yàn)椋海梗础妫担恚椋睿唬梗础妫常埃螅担怠妫叮埃螅罚病妫梗埃螅常祩€(gè)循環(huán)；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物在１．０％瓊脂糖凝膠、１×ＴＡＥ電泳液中電泳３５ｍｉｎ（電壓為１２０Ｖ），切下目的片段，用ＱＩＡＥＸＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，德國(guó)）柱式ＤＮＡ膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物。回收所得產(chǎn)物與ＰＭＤ１９－Ｔ載體在４℃下連接１６ｈ，然后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入由大腸桿菌ＤＨ－５α所制的感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞在含有Ｘ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ和氨芐青霉素的ＬＢ瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)１２ｈ，通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得陽(yáng)性克隆。至少有３個(gè)陽(yáng)性克隆送至英俊公司，用ＡＢＩ３７７型自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物為Ｍ１３＋／Ｍ１３－。為了保證測(cè)序的準(zhǔn)確性，對(duì)所得序列的正、反鏈進(jìn)行測(cè)定并加以校準(zhǔn)。

１．３數(shù)據(jù)分析

根據(jù)文獻(xiàn)［１２］，對(duì)ＰＨＹＰ和ＰＨＹＢ的分析是以地錢(qián)類(lèi)風(fēng)兜地錢(qián)為外類(lèi)群。序列經(jīng)ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１［１３］軟件比對(duì)，個(gè)別位點(diǎn)進(jìn)行適當(dāng)人工校正。采用最大簡(jiǎn)約法（ＭａｘｉｍｕｍＰａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。空位（Ｇａｐ）被編碼為缺失（Ｍｉｓｓｉｎｇ）。ＭＰ分析使用ＰＡＵＰ［１４］軟件進(jìn)行，采用如下選項(xiàng)：樹(shù)二組重新連接（ＴｒｅｅＢｉｓｅｃｔｉｏｎ－ｒｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ，ＴＢＲ）、啟發(fā)式搜索（Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃｓｅａｒｃｈ）、多重性選擇（ＭＵＬＴＲＥＥＳｏｐｔｉｏｎ）、ＡＣＣＴＲＡＮ優(yōu)化和１００次隨機(jī)附加的重復(fù)。利用自展分析（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ，１０００次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的置信度。在該研究中，采用ＰＡＭＬ４［１５］分析方法中的３個(gè)模型：分支模型［１６］、位點(diǎn)模型［１７－１８］以及分支－位點(diǎn)模型［１９－２０］進(jìn)行分析。采用系統(tǒng)發(fā)育分析得到的ＭＰ樹(shù)文件，以及該分析中的密碼子矩陣。目的分支在圖１中以字母標(biāo)出，ω０是背景比率。整個(gè)分析采用ＰＡＭＬ４軟件包中的Ｃｏｄｅｍｌ程序完成。

２結(jié)果與分析

２．１構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖１是基于裸子植物ＰＨＹＰ和被子植物ＰＨＹＢ光感受區(qū)序列構(gòu)建的ＭＰ樹(shù)，這２個(gè)類(lèi)型的光敏色素分別聚在不同的２個(gè)分支。在ＰＨＹＰ分支中，紅豆杉＋白豆杉與香榧＋穗花杉形成姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝８３），然后和三尖杉聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝９５），池杉和柳杉＋日本柳杉形成一個(gè)分支且得到有力支持（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），該分支同紅豆杉科和三尖杉科聚在一起（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００），共同構(gòu)成歐洲赤松的姊妹群（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。在ＰＨＹＢ分支中，單子葉植物水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＪａｐｏｎｉｃａ）＋高粱（Ｓｏｒｇｈｕｍｂｉｃｏｌｏｒ）形成一個(gè)分支，雙子葉植物馬鈴薯（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ，ｔｏｍａｔｏ）、楊（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｅｍｕｌａ）、擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）形成另外一個(gè)分支，支持率很高（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ＝１００）。