黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

　　摘　要：鏈格孢屬是重要的植物病原菌，種類繁多，常給作物生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。2019 年在黑龍江省齊齊哈爾黃瓜保護(hù)地大棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)了疑似鏈格孢侵染的黃瓜病害。采集的病樣經(jīng)病原菌分離培養(yǎng)、純化及致病性測(cè)定后，采用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)分析進(jìn)行了病原鑒定。鑒定結(jié)果顯示，黑龍江省黃瓜保護(hù)地大棚內(nèi)發(fā)現(xiàn)的葉斑病病原為 Alternaria alternata。對(duì)該病菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究表明，菌絲生長(zhǎng)最快的培養(yǎng)基是 CA 和黃瓜煎汁培養(yǎng)基;最適碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為蛋白胨;最適培養(yǎng)條件為 28 ℃，pH 8～9;致死溫度為 55 ℃ 10 min;光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大。最適合病菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為 PDA 和 CA 培養(yǎng)基，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨;培養(yǎng)條件為 28 ℃、pH 8～9、12 h 光照 /12 h 黑暗時(shí)產(chǎn)孢量最大。

　　劉行風(fēng); 劉東; 陶磊; 潘春清; 李雪蓮; 馬天; 潘夢(mèng)佳; 張艷菊， 中國(guó)蔬菜 發(fā)表時(shí)間：2021-08-13

　　關(guān)鍵詞：黃瓜鏈格孢葉斑病;病原鑒定;生物學(xué)特性;交鏈格孢

　　鏈格孢(Alternaria)在分類上屬于半知菌絲孢綱絲孢目暗色菌科，是重要的植物病原真菌，寄主范圍和地理分布廣，不僅能夠侵染農(nóng)作物、水果和蔬菜，對(duì)全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，還可引起人類和動(dòng)物的許多疾病(孫霞，2006)。鏈格孢在其侵染過程中，可產(chǎn)生 70 余種毒素及次生代謝產(chǎn)物，在農(nóng)作物中常可檢測(cè)出交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)、細(xì)交鏈孢菌酮酸(TeA)、騰毒素(TEN)等毒素。這些毒素具有致畸性、致死性、致癌性、致突變性、細(xì)胞毒性、急性毒性和胚胎毒性，對(duì)人類的潛在危害也非常大(郭詩(shī)曼和馮啟，2020)。

　　鏈格孢屬真菌種類繁多，寄主廣泛。目前已發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌有近 500 種，依據(jù)寄主的數(shù)目，鏈格孢屬位于近 2 000 種真菌屬中的第 10 位(Farr et al.，1990;孫霞，2006)。茄鏈格孢(A. solani)和蕓薹鏈格孢(A. brassicae)是世界性分布的種(Rotem，1997)，引起茄科蔬菜早疫病和十字花科蔬菜黑斑病(云曉敏 等，2015;馮中紅和孫廣宇，2020;王燕榮 等，2021)。在葫蘆科蔬菜上，由鏈格孢屬引起的病害通常稱為鏈格孢葉斑病，又稱葉枯病，甜瓜、西葫蘆、南瓜、黃瓜等瓜類作物均可感染(王瑩瑩，2016)。近年來我國(guó)葫蘆科蔬菜栽培面積不斷擴(kuò)大、品種增多并不斷更替，導(dǎo)致葫蘆科蔬菜鏈格孢葉斑病危害加重。賈菊生和李新輝(2002)對(duì)新疆瓜類由鏈格孢侵染所致的兩類葉斑病病原進(jìn)行了研究，結(jié)果將新疆瓜類作物上 Alternaria 引起的葉斑病分為 2 個(gè)組群，一組是在哈密瓜和西瓜上表現(xiàn)的黑斑病類型，病原為 A. cucumerina;另一組是在黃瓜上表現(xiàn)的褐斑病類型，由 A. cucurbitae 引起。楊克澤等(2009)對(duì)甘肅省武威市南瓜葉枯病進(jìn)行鑒定，認(rèn)為是由瓜鏈格孢 A. cucumerina 侵染引起的;除南瓜外，也有研究表明 A. cucumerina 可以侵染黃瓜，他們對(duì)黃瓜抗病種質(zhì)資源進(jìn)行了研究，并應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了黃瓜應(yīng)答黑斑病菌脅迫的機(jī)理及抗病候選基因(李淑菊 等，2012;王惠哲 等，2016;劉東 等，2017; Sa et al.，2020)。王瑩瑩(2016)對(duì)北京、河北、河南、甘肅、遼寧、黑龍江、湖南、湖北等 12 個(gè) 省市 9 種葫蘆科蔬菜上發(fā)生的鏈格孢葉斑病進(jìn)行鑒定，鑒定出交鏈格孢(A. alternata)、西葫蘆生鏈格孢(A. ponicola)和瓜鏈格孢(A. cucumerina)，其中在甘肅省酒泉市和山東省壽光市黃瓜上采集的病菌為 A. alternata。由此可見，A. cucurbitae、A. alternata 和 A. cucumerina 均可侵染黃瓜。

　　2019 年?yáng)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院黃瓜課題組在黑龍江省黃瓜病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)了鏈格孢侵染疑似病株，為明確黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原種類，采集了病樣進(jìn)行病原鑒定，并對(duì)病原生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為黑龍江省黃瓜病害綜合防治提供理論依據(jù)。

　　1　材料與方法

　　1.1　黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病病原鑒定

　　1.1.1　田間癥狀調(diào)查及病樣采集　2019 年 6 月在黑龍江省齊齊哈爾市大民村采集疑似病樣，記錄癥狀并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步分離、鑒定。

　　1.1.2　病原菌分離、純化　采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化。取病健交界處組織，切成 3～4 mm 正方小塊，經(jīng) 75% 酒精表面消毒及 0.1% 升汞消毒后，用無菌水清洗 3 次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)。菌落長(zhǎng)出后進(jìn)行單孢分離純化(張笛 等，2020)。

　　1.1.3　致病性測(cè)定　將純化的菌株接種到 PDB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，130 r · min-1 振蕩培養(yǎng) 7 d 后，用滅菌雙層紗布過濾，離心后，用無菌水配制成濃度為 1 × 107 個(gè) · mL-1 的孢子懸浮液。

　　黃瓜自交系 D1801 用于病菌致病性測(cè)定。黃瓜種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。供試黃瓜種子經(jīng) 5% 次氯酸鈉溶液消毒 10 min，用清水沖洗，放入墊有 2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃催芽。待胚根長(zhǎng)至 0.5 cm 左右時(shí)，播種于裝有滅菌蛭石的塑料育苗缽內(nèi)，每缽播 1 粒，26 ℃ 人工氣候箱中培養(yǎng)。待黃瓜第 1 片真葉展平，采用噴霧接種法苗期接種。接種后保濕 24 h，置于 26 ℃ /18 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。接種后 10 d 調(diào)查發(fā)病情況(劉東 等，2017)。根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行再分離，顯微鏡觀察確定分離病菌與原接種菌是否一致(張艷菊 等，2014)。

　　1.1.4　病原菌形態(tài)學(xué)觀察　將分離純化的菌株接種到 PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng) 6 d，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色。通過光學(xué)顯微鏡觀察分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)、大小、顏色，測(cè)量分生孢子大小。

　　1.1.5　病原菌分子生物學(xué)鑒定　采用 SDS 法提取病原菌的基因組 DNA(趙春梅和郭晶，2019)。用移菌鉤將培養(yǎng)基表面菌絲刮下，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的離心管中，加液氮迅速研磨;向離心管中加入 400 μL TE 和 80 μL SDS，搖晃混勻;65 ℃水浴 30 min，每 10 min 顛倒 1 次;向離心管中加入 100 μL KAc(5 mol · L-1 )，搖晃 6 s，上下顛倒幾次，冰浴 30 min;向離心管中加入 500 μL 氯仿 - 異戊醇( 氯 仿∶異 戊 醇 為 24∶1)，13 000 r · min-1 離心 10 min，抽提 2 次;離心后取上清液到 1 個(gè)新的離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，沉降 30 min;13 000 r · min-1 離心 10 min，棄上清液。加入 1 000 μL 70% 酒精吹洗沉淀，13 000 r · min-1 離心 5 min，重復(fù)此步驟 2 次。棄上清液，室溫晾置 5～10 min，加入 50 μL TE 溶解 DNA。

　　采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)、ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和抗原相關(guān)蛋白基因引物 Alt a 1-F(5′-ATGCAGTTCACC ACCATCGC-3′)、Alt a 1-R(5′-ACGAGGGTGAYG TAGGCGTC-3′)(Miguel et al.，2010)，對(duì)病原菌基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。引物由哈爾濱擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系(20 μL)： 2× PCR Master mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各 0.5 μL，模板 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 2 min;94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將 PCR 產(chǎn)物委托哈爾濱擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的 DNA 序列同基因組 GenBank 中公布序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

　　1.2　黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病菌生物學(xué)特性研究

　　供試菌株為采集自齊齊哈爾 1.1 中分離鑒定的病菌。

　　1.2.1　培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　制備胡蘿卜煎汁培養(yǎng)基(CA)、胡蘿卜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基(PCA)、白菜煎汁培養(yǎng)基(CCA)、白菜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基(PCCA)(張俊華 等，2018)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、黃瓜煎汁培養(yǎng)基、黃瓜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基(吳橋，2017)。將菌株活化并打取直徑 0.75 cm 的菌碟，移至不同培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng) 6 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。待菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，用 10 mL 無菌水洗下菌落表面孢子，制成孢子懸浮液，采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子濃度，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。

　　1.2.2　營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

　　以查氏培養(yǎng)基(Czapek)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(王雪 等， 2019)，將其中的碳源依次等量替換為葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉及甘露醇，并設(shè)缺碳對(duì)照，研究不同碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響。將氮源依次等量替換為磷酸氫二銨、甘氨酸、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸鈉，并設(shè)缺氮對(duì)照，研究不同氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響。將菌株活化并打取直徑 0.75 cm 的菌碟，移至不同培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同 1.2.1，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。

　　1.2.3　溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　將直徑 0.75 cm 的菌碟接種到 PDA 平板上，依次在 20、25、28、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同 1.2.1，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。

　　1.2.4　光照對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　將直徑 0.75 cm 的菌碟接種到 PDA 平板上，依次放置在黑暗、光照、12 h 光照 /12 h 黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同 1.2.1，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。

　　1.2.5 pH 對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　將直徑 0.75 cm 的菌碟接種到不同 pH 值(4、5、6、7、8、 9、10、11、12)的 PDA 平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，菌落直徑和產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同 1.2.1，每個(gè)處理 5 次重復(fù)。

　　1.2.6　病菌致死溫度的測(cè)定　將直徑 0.75 cm 的菌碟裝入 2.0 mL 離心管內(nèi)，分別放入 40、45、50、 55、60 ℃恒溫水浴鍋中分別水浴 5、10、15 min。水浴后，依次接種到 PDA 平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng) 6 d，每個(gè)處理 5 次重復(fù)，觀察菌株是否生長(zhǎng)， 確定菌株的致死溫度。

　　1.2.7　數(shù)據(jù)處理與分析　采用 DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析，采用 LSD 法對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較。

　　2　結(jié)果與分析

　　2.1　黃瓜鏈格孢葉斑病病原的分離與鑒定

　　2.1.1　田間癥狀調(diào)查　田間黃瓜鏈格孢葉斑病疑似病樣主要危害黃瓜葉片，葉片正面和背面均可受害，病斑圓形或不規(guī)則形，4～5 mm，黃褐色至棕褐色，病斑周圍有褪綠暈圈，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病斑連片，葉肉組織枯死，葉片似火烤狀但不脫落(圖 1)。

　　2.1.2　致病性測(cè)定　分離得到的菌株于黃瓜第 1 片真葉展開時(shí)噴霧接種，7 d 后葉片出現(xiàn)褪綠斑，之后病斑連片，葉肉組織壞死;葉柄及莖部病斑初期水漬狀，后變褐色，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉片枯死(圖 2)。對(duì)接種發(fā)病的黃瓜組織再次分離，得到相同的病原菌。

　　2.1.3　病原菌形態(tài)特征　病原菌在 PDA 平板上培養(yǎng)，菌落初為白色，質(zhì)地致密，之后菌落中心顏色逐漸加深呈棕黑色，菌落背面外緣白色，中間為棕黑色至純黑色(圖 3-a、3-b)。分生孢子梗多分枝(圖 3-c)。分生孢子單生或串生，倒梨形、倒棍棒形、卵形或近橢圓形，淡褐色至褐色，有 2～8 個(gè)橫隔，0～4 個(gè)縱隔，有的有 1～3 個(gè)斜隔膜，有的孢子呈網(wǎng)狀分隔，孢子長(zhǎng) 8.0～62.0 μm，寬 4.0～19.0 μm，有的孢子有 2.0～20.0 μm 假喙，圓柱狀，部分孢子的假喙有分枝(圖 3-d、3-e)。

　　2.1.4　病原菌分子鑒定　采用 rDNA ITS 和抗原相關(guān)蛋白 Alt a 1 兩對(duì)引物對(duì)病菌基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，分別得到 523 bp 和 486 bp 的條帶(圖 4)。將測(cè)序所得序列進(jìn)行 BLAST 同源性比對(duì)，兩序列結(jié)果均顯示該病原菌與交鏈格孢 Alternaria alternata 的同源性達(dá) 99% 以 上， 結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定引起黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病的病原菌為交鏈格孢 Alternaria alternata。

　　2.2　黃瓜鏈格孢葉斑病菌生物學(xué)特性

　　2.2.1　培養(yǎng)基對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　菌株在 CA 培養(yǎng)基和黃瓜煎汁培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較快，菌絲生長(zhǎng)速度顯著快于在 PCCA、PSA、CCA、PDA 和 PCA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，在 PCA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最慢(圖 5)。在 PDA 和 CA 培養(yǎng)基上病菌產(chǎn)孢量較高，其次為黃瓜煎汁培養(yǎng)基，CCA、PCA、PSA 和黃瓜馬鈴薯煎汁培養(yǎng)基上產(chǎn)孢較少，在 PCCA 上未見產(chǎn)孢(圖 5)。

　　2.2.2　碳源對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　當(dāng)碳源為葡萄糖或蔗糖時(shí)，菌落直徑最大，顯著高于其他碳源處理。當(dāng)碳源為果糖時(shí)病菌菌絲生長(zhǎng)最慢。從產(chǎn)孢能力來看，葡萄糖最適合病菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量最高，為 1.56 × 106 個(gè) · mL-1 ，顯著高于其他碳源處理。產(chǎn)孢量的大小依次為：葡萄糖>蔗糖>乳糖>甘露醇>可溶性淀粉>果糖和缺碳對(duì)照(圖 6)。

　　2.2.3　氮源對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　相較于其他 4 種氮源處理，蛋白胨處理的菌落直徑最大，顯著高于其他氮源處理。其次是酵母浸粉、甘氨酸和硝酸鈉，磷酸氫二銨的效果最差。從產(chǎn)孢量來看，和菌絲生長(zhǎng)的變化趨勢(shì)基本一致，蛋白胨處理的產(chǎn)孢量最高，為 7.31 × 105 個(gè) · mL-1 ，產(chǎn)孢量大小依次為蛋白胨>酵母浸粉>甘氨酸>硝酸鈉>磷酸氫二銨>缺氮對(duì)照(圖 7)。

　　2.2.4　溫度對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　從圖 8 中可以看出，28 ℃時(shí)菌落直徑最大，與其他處理具有顯著差異，其次為 25、20 ℃和 30 ℃，35 ℃和 40 ℃時(shí)菌落直徑增長(zhǎng)極其緩慢，已經(jīng)非常不適合菌株生長(zhǎng)。從產(chǎn)孢量來看，28 ℃時(shí)菌株產(chǎn)孢量最大，顯著高于其他處理;25 ℃ 次之;30 ℃處理雖然比 20 ℃處理的菌絲生長(zhǎng)速率慢，但產(chǎn)孢量顯著高于 20 ℃處理;40 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最低。

　　2.2.5　光照對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　不同光照處理下菌絲生長(zhǎng)情況基本一致，各處理間差異不顯著。從產(chǎn)孢量來看，光暗交替處理的產(chǎn)孢量最多，為 2.08 × 106 個(gè) · mL-1 ，顯著高于 24 h 黑暗處理(圖 9)。

　　2.2.6 pH 對(duì)黃瓜鏈格孢葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響　菌絲在 pH 4～12 時(shí)均能生長(zhǎng)，但菌絲在 pH 為 8 和 9 時(shí)生長(zhǎng)速度最快，高于其他 pH 處理，pH 為 4 和 11、12 時(shí)生長(zhǎng)緩慢;病菌在 pH 5～12 范圍內(nèi)能夠產(chǎn)孢，產(chǎn)孢的最適 pH 為 8～9，顯著高于其他 pH 處理(圖 10)。

　　2.2.7　病菌致死溫度　病菌在 40、45、50 ℃恒溫水浴鍋中加熱 5、10、15 min，在 28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng) 6 d，在 PDA 培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng);55 ℃ 5 min 加熱處理的菌株也可以生長(zhǎng)，但 55 ℃ 加熱 10 、15 min 和 60 ℃加熱條件下菌株均不能生長(zhǎng)。因此，病菌的致死溫度是 55 ℃ 10 min。

　　3　結(jié)論與討論

　　鏈格孢屬(Alternaria)真菌是一類重要的植物病原菌。一直以來，瓜鏈格孢 A. cucumerina 被認(rèn)為是引起黃瓜葉斑病的主要病原菌(孫玉河 等， 2012)。但賈菊生和李新輝(2002)、王瑩瑩(2016)等研究發(fā)現(xiàn) A. alternata、A. cucurbitae 也可以侵染黃瓜引起病害。本文通過對(duì)黃瓜鏈格孢疑似病樣的病菌進(jìn)行形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定，將黑龍江省齊齊哈爾黃瓜大棚內(nèi)發(fā)生的葉斑病病原鑒定為 A. alternata。

　　鏈格孢菌種類繁多，我國(guó)記載的鏈格孢屬真菌有 123 個(gè)種及變種(馮中紅和孫廣宇，2020)，主要根據(jù)分生孢子形狀、大小、顏色、分隔、喙的特征、成鏈特性、產(chǎn)孢表型對(duì)鏈格孢種進(jìn)行劃分(Neegaard，1945)。雖然根據(jù)形態(tài)可以區(qū)分大部分鏈格孢種，但是營(yíng)養(yǎng)條件、溫度、光照、pH 等環(huán)境條件極易影響鏈格孢的形態(tài)特性，尤其是對(duì)喙短或者無喙的小孢子種，導(dǎo)致種的鑒定更加困難(馮中紅和孫廣宇，2020)。而分子生物學(xué)鑒定為鏈格孢種的鑒定提供了有力手段，ITS、ATP、gpd、CAL、 actin 等序列已用于區(qū)分鏈格孢屬及其相近屬，尤其 Alt a 1 是鏈格孢屬真菌特有序列，在鏈格孢屬真菌尤其是小孢子種中差異性較大，可將 77% 以上的供試菌株鑒定到種，已逐漸被廣泛應(yīng)用于鏈格孢種的分類鑒定(Miguel et al.，2010)。因此本文采用菌株 ITS 序列和 Alt a 1 序列相結(jié)合，確定引起黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病的病原為 Alternaria alternata。

　　Alternaria alternata 寄主廣泛，可引起木薯白點(diǎn)病、水稻褐變穗病、紫花苜蓿斑點(diǎn)病等病害。盡管已有 A. alternata 生物學(xué)特性的研究，但在不同作物上已有的研究結(jié)果并不一致(聶啟軍 等，2016;馬連杰 等，2018;張俊華 等，2018;鄭肖蘭 等， 2018;蔡吉苗 等，2019;方婷，2019)。本試驗(yàn)對(duì)黑龍江省采集的 A. alternata 生物學(xué)特性研究表明，菌絲生長(zhǎng)最快的培養(yǎng)基是 CA 和黃瓜煎汁培養(yǎng)基;最適碳源為葡萄糖和蔗糖，氮源為蛋白胨;最適培養(yǎng)條件為 28 ℃，pH 8～9;致死溫度為 55 ℃ 10 min;光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大。最適合病菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為 PDA 和 CA 培養(yǎng)基，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨，培養(yǎng)條件為 28 ℃、pH 8～9、12 h 光照 /12 h 黑暗時(shí)產(chǎn)孢量最大。

　　黃瓜鏈格孢葉斑病為氣傳病害，病菌在病殘?bào)w及種子上越冬成為翌年初侵染源。種子帶菌是病害遠(yuǎn)距離傳播的重要途徑，也是常發(fā)區(qū)初侵染源之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Alternaria alternata 的致死溫度是 55 ℃ 10 min，可以利用這一特性，在播種前對(duì)黃瓜種子進(jìn)行溫湯處理，對(duì)于未發(fā)生地區(qū)可以從源頭上杜絕病害的發(fā)生，常發(fā)區(qū)也可以減輕由種子帶菌所造成的損失。在黃瓜的保護(hù)地生產(chǎn)中，農(nóng)民通常會(huì)采用高溫悶棚的方法來防治黃瓜霜霉病等病害。高溫悶棚的最佳溫度是 45 ℃，低于 42 ℃效果不好，高于 48 ℃植物生長(zhǎng)會(huì)受害(楊海燕 等， 2019)。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃瓜鏈格孢葉斑病菌的最適培養(yǎng)條件為 28 ℃，35 ℃及 40 ℃時(shí)雖然病菌生長(zhǎng)受到抑制，但尚可存活，只有在 55 ℃以上時(shí)才完全不能生長(zhǎng)。因此在生產(chǎn)中如果采用高溫悶棚的方法，雖然可以使病菌生長(zhǎng)受到抑制，但不能完全致死，一旦環(huán)境條件適合還會(huì)繼續(xù)危害。

　　Alternaria alternata 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最適的 pH 為 8～9，即在弱堿性條件下菌絲生長(zhǎng)較快，產(chǎn)孢量大。pH 5～7 時(shí)即中性偏酸條件下，菌絲生長(zhǎng)較緩慢，尤其是產(chǎn)孢量顯著降低。根據(jù)這一特性，在有黃瓜鏈格孢葉斑病發(fā)病的田塊，可盡量選擇弱酸性的葉面肥以及農(nóng)藥，以達(dá)到更好的防治效果。

　　本試驗(yàn)明確了黑龍江省黃瓜鏈格孢葉斑病菌生長(zhǎng)與環(huán)境條件的關(guān)系，對(duì)于病害綜合防治具有重要意義。